VO Biophysik II, Prof. Pohl, SS 2008

Aus BioSalzburg

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Der folgende ausgearbeitete Fragenkatalog stammt von Linzer Biophysik StudentInnen; das Orginal-Wikifile findet ihr unter

http://90.146.85.0/physikforum-wiki/index.php/Biophysik_2.

Inhaltsverzeichnis 1 1. Die Membranproteinfaltung erfolgt in zwei grundlegenden Strukturen. Benennen Sie diese, und gehen Sie auf Gemeinsamkeiten und Unterschiede im Aufbau und beim Insertionsprozess in die Membran ein! 2 2. Welche strukturellen Gemeinsamkeiten kennzeichnen aus β - Faltblättern bestehende Membranproteine? 3 3. Welche strukturellen Gemeinsamkeiten kennzeichnen α-helikale Membranproteine? 4 4. Was versteht man unter einem hydrophoben Moment? 5 5. Wie unterscheidet sich die Periodizität in der Abfolge polarer/apolarer Aminosäuren zwischen helicalen Proteinen und ß-Faltblättern? 6 6. Was versteht man unter der hydrophoben Konstante? Welche Aussagen lassen sich mit ihrer Hilfe treffen? 7 7. Gruppieren Sie die Aminosäuren in folgende 4 Gruppen und skizzieren Sie die Präferenz von Vertretern dieser Aminosäuren für verschiedene Teile der Membran als Funktion der für ihre Insertion benötigten Energie vom Abstand zum Membranzentrum: 8 8. Erläutern Sie den Mechanismus, der zur Sekretion eines Poteins oder zur Insertion des Proteins in die Membran führt! 9 9. Erläutern Sie das der biologischen Hydrophobizitätsskala von Aminosäuren zugrunde liegende Experiment! 10 10. Welche Mechanismen der Topologieevolution von Membranproteinen sind Ihnen bekannt? Nennen Sie Beispiele! Was versteht man unter dynamischen Topologien von Membranproteinen? 11 11. Wie unterscheidet sich die ER-Proteintranslokation von der bakteriellen Proteintranslokation? 12 12. Skizzieren den Ablauf der co- und posttranslationalen Proteintranslokation! 13 13. Erläutern Sie das multimere und das monomere Modell des Translokationskanals. Welche experimentellen Fakten sprechen für jedes dieser Modelle? 14 14. Wie wird gewährleistet, dass der Translokationskanal impermeable für kleine Moleküle ist (zwei Modelle!) 15 15. Was versteht man unter "hydrophobic gating"? Führen Sie Beispiele an! 16 16. Wie wurde die Existenz des Translokationskanals im ER mit elektrophysiologischen Techniken nachgewiesen? Skizzieren Sie das Experiment! 17 17. Was versteht man unter Caged-Compounds? Geben Sie ein Beispiel für ihre Verwendung an! 18 18. Erklären Sie das Prinzip der Fluoreszenzmikrophotolyse zur Flussmessung durch Kanäle! 19 19. Vergleichen Sie das Matrixporin und das Maltoporin! 20 20. Erläutern Sie den Selektivitätsmechanismus im Maltoporin! Gehen Sie dabei insbesondere auf die engste Stelle im Kanal (constriction site) ein! 21 21. Erklären Sie die Strom-Spannungs-Charakteristik des Matrix Proteins von Escheria Coli! 22 22. Welche Exportwege für Proteine durch die äußere Membran von negativen Bakterien sind Ihnen bekannt? 23 23. Wie können Sie den Transport von Antibiotika durch Outer-Membrane-Proteins elektrisch verfolgen? Skizzieren Sie den Versuchsaufbau und das zu erwartende experimentelle Ergebnis! 24 24. Bitte erläutern Sie, wie Sie mit Hilfe der Rauschanalyse sowohl Amplitude als auch Anzahl der Kanäle bestimmen können! 25 25. Welchen strukturellen Gegebenheiten sind für Selektivität und hohe Transportrate der K+-Kanäle verantwortlich? 26 26. Erläutern Sie den Kalium-Transportzyklus im Selektivitätsfilter! 27 27. Was versteht man unter dem so genannten „induced fit“ beim KcsA? 28 28. Schätzen Sie ab, um welchen Betrag die energetische Barriere im Kaliumkanal durch die wassergefüllten Kammer (Radius = 5 Å) gesenkt wird? 29 29. Der Kalium- oder Rubidiumionenfluß durch Kaliumkanäle steigt nicht linear zur Ionenkonzentration an. Erläutern Sie diesen Aspekt! 30 30. Beschreiben Sie ein Experiment zur Bestimmung der Flusskopplung in Kaliumkanälen! 31 31. Wie lässt sich die Leitfähigkeit eines einzelnen Kaliumkanals für Wasser bestimmen? 32 32. Welche Experimente haben zum Strukturmodell des offenen KcsA Kanals geführt? Skizzieren Sie die Strukturveränderungen, die vonstatten gehen müssen, damit der Kanal vom geschlossenen zum offenen Zustand übergeht! Beschriften Sie die kritischen Aminosäurenreste! 33 33. Wie lässt sich der inaktivierte Zustand des Kaliumkanals nachweisen? Welche Interaktionen innerhalb des Kaliumkanalproteins sind für die Inaktivierung verantwortlich? 34 34. Welche Kraft treibt die Inaktivierung? Verdeutlichen Sie diese in einem Schema! Beschreiben Sie die zugrunde liegenden Experimente! 35 35. Welche strukturellen Modelle existieren zur Erklärung der Spannungsabhängigkeit des KvAP Kanals? Erläutern Sie diese! 36 36. Das Paddelmodell des KvAP geht davon aus, dass der Spannungssensor großräumige Bewegungen ausführt. Beschreiben Sie die funktionellen Experimente, mit denen dieses Modell untermauert wurde! 37 37. Erläutern Sie mindestens drei verschiedene experimentelle Ansätze, aus denen folgt, dass der Spannungssensor im KvAP nur kleine Distanzen zurücklegt! 38 38. Erläutern Sie die Verwendung von Elektronspinsonden zur Strukturaufklärung von Membranproteinen! 39 39. Welche Experimente liegen dem „Transporter-like“ Modell des KvAP Kanals zugrunde? 40 40. Erläutern Sie die Cross-Link-Versuche, die zum minimalen Modell des Schaltvorgangs in spannungsabhängigen Kaliumkanälen geführt haben. 41 41. Erläutern Sie Bolztmann-Theorie der Spannungsabhängigkeit von Kanälen! 42 42. Skizzieren Sie ein Energiediagramm für eine Pore, die prinzipiell zwei Zustände (offen, geschlossen) annehmen kann! Welche Änderung erfährt das Diagramm beim Anlegen einer Membranspannung für den Fall einer spannungsabhängigen Pore. Geben Sie eine mathematische Formulierung für die Fraktion der offenen Kanäle an! 43 43. Wie hängt die Geschwindigkeitskonstante der Kanalöffnung oder auch die Geschwindigkeitskonstante der Kanalschließung vom angelegten Potential ab? 44 44. Nehmen Sie an, bei einer Membranspannung von - 26 mV würden sich 50 % der Kanäle im offenen Zustand befinden. Berechnen Sie die stationäre Öffnungswahrscheinlichkeit für die Membranspannung von - 13 und - 39 mV! 45 45. Schlagen Sie einen experimentellen Ansatz zur Bestimmung der Torladung vor! 46 46. Wie hängt die Zeitkonstante eines Kanals vom Membranpotential ab? 47 47. Was versteht man unter einem so genannten „Tail Current“? 48 48. Welche Rolle kommt der Membrandeformationsenergie bei der Inhibierung von Kanälen zu? 49 49. Wie groß ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein Kanal, der zum Zeitpunkt t noch offen ist zum Zeitpunkt t + Δt schließt? 50 50. Leiten Sie den prinzipiellen Verlauf einer Überlebensfunktion her und skizzieren Sie diesen! 51 51. Was ist ein Öffnungsdauer-Histogramm? Wie wird es erstellt? Wie lässt sich die mittlere Öffnungsdauer eines Kanals ermitteln? 52 52. Vergleichen Sie die Struktur des Selektivitätsfilters vom K und NaK Kanal! Welche Aussagen lassen sich daraus für die Selektivitätsmechanismen der Kaliumkanäle ableiten? 53 53. Welche Rolle hat die Flexibilität des Filters für die Kanalselektivität? 54 54. Welcher Zusammenhang besteht zwischen mittlerer Hydratationszahl der Ionen im Filter und Kanalselektivität? 55 55. Benennen Sie wenigsten drei Krankheitsbilder, die durch Mutationen an Aquaporinen verursacht werden! Zeigen Sie dabei jeweils den Mechanismus auf, der zum Ausbruch der Krankheit führt! 56 56. Erklären Sie den Selektivitätsmechanismus der Aquaporine, der zum Ausschluss von Anionen, Kationen und Protonen führt! 57 57. Worin unterscheiden sich orthodoxe Aquaporine von Aquaglyceroproteinen? Skizzieren Sie die Änderungen im Selektivitätsfilter, die zur Änderung der Kanalpermeabilität geführt haben! 58 58. Aquaporin-2 spielt eine wichtige Rolle in der Regulation des Wasserhaushaltes des Menschen. Erläutern Sie diese! 59 59. Erläutern Sie das Prinzip der Wasserflussmessungen mittels Laser-Scanning-Reflection-Microscopy! 60 60. Nennen Sie Argumente für und gegen eine Rolle von Aquaporinen im Gastransport! 61 61. Erläutern und skizzieren Sie die prinzipiellen Unterschiede im Aufbau von Anionen- und Kationenkanälen! 62 62. Welche Transportwege kann Wasser durch epitheliale Barrieren nehmen? 63 63. Welche Argumente sprechen für einen primär transzellulären Transport? Erläutern Sie die entsprechenden Experimente! 64 64. Wägen Sie die Argumente für oder gegen den sekundär aktiven Wassertransport gegeneinander ab! 65 65. Berechnen Sie den maximalen Glukosegradienten, gegen den der SGLT1 Glukose aus dem Darm aufnehmen kann! Gehen Sie von den üblichen intra- und extrazellulären Natriumkonzentrationen aus. 66 66. Beschreiben Sie das spannungsabhängige Schalten des Chlorkanals ClC0! Skizzieren Sie den Verlauf der Öffnungswahrscheinlichkeit von der angelegten Spannung! 67 67. Worin unterscheiden sich die geschlossene und offene Konformation des Chlorkanals? 68 68. Wie wurde nachgewiesen, dass es sich beim Protein ClC - EC1 nicht um einen Kanal, sondern um einen Carrier handelt? 69 69. Skizzieren Sie den prinzipiellen Aufbau und den experimentellen Verlauf zum Nachweis des chlorgetriebenen Protonentransports! 70 70. Skizzieren Sie den prinzipiellen, experimentellen Aufbau, und erläutern Sie ein Experiment zum Nachweis des protonengetriebenen Chlortranports mit Hilfe von Proteoliposomen! 71 71. Skizzieren Sie die wichtigsten Strukturelemente des Acetylcholinrezeptors und benennen Sie diese! 72 72. Vergleichen Sie die freien Energien der Konformationsänderungen im gebundenen und freien Zustand des Rezeptors! 73 73. Der Anteil eines Rezeptors im funktionellen Zustand hängt von der Konzentration des Liganden ab. Bitte geben Sie einen entsprechenden Ausdruck für ein allosterisches Protein mit einer einzigen Bindungsstelle an! Erläutern Sie diesen anhand der entsprechenden Reaktionsgleichung! 74 74. Der Acetylcholinrezeptor hat zwei Bindungsstellen. Wie können Sie mit elektrophysiologischen Experimenten nachweisen, ob beide Bindungsstellen gleichwertig sind? 75 75. Wieso unterscheiden sich die zwei Bindungsstellen des Acetylcholinrezeptors in ihrer Affinität zu Acetylcholin? 76 76. Zeigen Sie anhand der Bindungsenergien, dass der Acetylcholinrezeptor mindestens zwei Moleküle binden muss, um seine Funktion zu erfüllen! 77 77. Wie sind Agonistbindung und Kanalöffnung im Nicotinreceptor gekoppelt? Beschreiben Sie ein Experiment zum Nachweis dieser Kopplung! 78 78. Wie funktioniert die Weitergabe der Information über die Acetylcholine-Bindung an den eigentlichen Kanal, d.h. wie ist die Kanalöffnung an die Ligandenbindung gekoppelt? 79 79. Welche ATPase Klassen gibt es? Worin unterscheiden sie sich? 80 80. Skizzieren Sie den Post-Alberts Cycle für die Ca und die Na/K ATPAse! 81 81. Aus welchen Unterheiten bestehen die P-Type ATPasen? Skizzieren Sie, wie diese Untereinheiten miteinander interagieren um Ionen über die Membran zu pumpen! 82 82. Welche der Transportschritte der Na/K ATPase sind elektrogen und wie wurde das nachgewiesen? 83 83. Führen Sie ein Schema des Transportzyklus der Na/K ATPase an, aus dem die Rolle der Protonen und der Kanalokklusion ersichtlich wird.

1. Die Membranproteinfaltung erfolgt in zwei grundlegenden Strukturen. Benennen Sie diese, und gehen Sie auf Gemeinsamkeiten und Unterschiede im Aufbau und beim Insertionsprozess in die Membran ein!

Strukturen: α-Helix, β-Faltblatt

Helix-Bundle Proteine sind in allen zellulären Membranen, ausgenommen der äußeren bakteriellen Membran, zu finden. β-barrel Proteine befinden sich in der äußeren Membran. Sie besitzen zudem ein Signalpeptid am N-Terminus. Gemeinsam sind allen integralen Membranproteinen (α-bundle, β-barrel) folgende Oberflächencharakteristika: Ein Band aus hydrophoben (idR. aliphatischen) Aminosäuren, flankiert durch zwei aromatische Gürtel aus Trp und Tyr. Dies spiegelt die Struktur des umgebenden Lipid-Bilayer wieder:

Kopfgruppen ↔ aromatischer Gürtel, Schwanz-Region ↔ hydrophobes Band

Durch diese Konfiguration wird gewährleistet, dass die Proteine lückenlos in die Membran passen.

Insertion:

• Typ α-Helix: Die Insertion eines Helix-Bundles erfolgt cotranslational. Die Transmembranhelices bewegen sich nach ihrer Translation vor Ort aus dem am Translocon (in E. coli SecYEG) sitzende Ribosom lateral durch das Translocon in die umgebende Lipid-Doppelschicht (entweder einzeln oder paarweise). Dies geschieht, weil im Translocon ein wässriges Milieu herrscht und der Helix ein Membrankontakt durch Transloconöffnung gestattet wird. In der Membran ist es für die Helix energetisch günstiger -->sie geht raus. Das Arrangement der Helices zu Proteinstrukturen in der Membran geschieht durch die günstigere WW untereinander als mit dem umgebenden Lipid, H-Brücken-Bildung etc.

• Typ β-barrel: Diese werden im Cytoplasma synthetisiert und posttranslational mit Hilfe der SecA-ATPase durch den Translocon-Kanal durchgeschoben. Die transmembranen β-Stränge sind nicht hydrophob genug, um in der inneren Membran stecken zu bleiben. Mit Hilfe von Chaperonen werden sie durch die wässrige Umgebung des Periplasmas transportiert und durch den YadC- (bzw YaeT?)-Komplex in die äußere Membran eingebaut. Das Chaperon hilft bei der Faltung (verhindert Mißfaltung) durch bestimmte hydrophobe Zonen.

Quelle: 01_protein_assembly_08.pdf, Seiten 2-4 Paper: Elofsson, 2007, Annu.Rev.Biochem., 76, page3-4

2. Welche strukturellen Gemeinsamkeiten kennzeichnen aus β - Faltblättern bestehende Membranproteine?

• gerade Anzahl an β-Strängen
• N und C Termini befinden sich im gleichen Kompartiment, dem Periplasma
• die einzelnen β-Stränge sind um etwa 45° gekippt
• alle β-Stränge sind antiparallel und zu ihren nächsten Nachbarn entlang der Kette verbunden.
• Die β-Barrel Obefläche, welche in Kontakt mit dem apolaren Membraninneren steht, besteht aus einem Band aus aliphatischen Seitenketten und wird von 2 Gürteln aus aromatischen Seitenketten eingerahmt.
• AAs im Durchschnitt periodisch in ihrer Hydrophobizität mit der typischen β-Struktur-Periode von 2.3

Quelle: 01_protein_assembly_08.pdf, Seite 7

3. Welche strukturellen Gemeinsamkeiten kennzeichnen α-helikale Membranproteine?

• Transmembrane α-Helices
• Interfacial Helices: diese liegen flach auf der Membran (an der Berührungsfläche Membran –wässrige Phase)
• Reentrant Loops: Helices die nicht durch die gesamte Membran reichen.
• außerhalb der Membran befindliche globuläre Domänen
• in α-Helices von Proteinen treten Alanin, Leucin und Valin bevorzugt auf, sie begünstigen die Bildung dieses Sekundärstrukturelements und werden deshalb auch als "Helixbildner" bezeichnet.
• AAs im Durchschnitt periodisch in ihrer Hydrophobizität mit der Helix-Periode von 3.6
• Clusterung von Trp und Tyr im Bereich der Lipidköpfe, v.a. hydrophobe AAs im Mittelbereich

Quelle: 01_protein_assembly_08.pdf Seite 9

4. Was versteht man unter einem hydrophoben Moment?

Analog zum Dipolmoment ist das hydrophobe Moment für eine Struktur aus N Aminosäuren definiert als , mit H_n der jeweiligen numerischen Hydrophobizität einer Aminosäure (d.h. wie apolar/polar sie ist) und s_n dem jeweiligen Einheitsvektor vom α-C-Atom zum geometrischen Zentrum der Seitenkette. Es beschreibt die "gesamte" Amphiphilizität der Struktur.

Quelle: 01_protein_assembly_08.pdf Seite 15

Paper: Eisenberg et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 81 (1): 140-144, 1984

5. Wie unterscheidet sich die Periodizität in der Abfolge polarer/apolarer Aminosäuren zwischen helicalen Proteinen und ß-Faltblättern?

Sequenzen, welche α-Helices ausbilden, neigen dazu, eine starke Periodizität in ihrer Hydrophobizität von 3.6 Residuen aufzuweisen. Jene Sequenzen welche ß-Faltblättern ausbilden weisen eine Periodizität von durchschnittlich 2.3 Rediduen auf. Die Periodizität deckt sich jeweils mit der allgemeinen Periodizität der Strukturen.

Quelle: 01_protein_assembly_08.pdf Seite 15

Paper: Eisenberg et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 81 (1): 140-144, 1984

6. Was versteht man unter der hydrophoben Konstante? Welche Aussagen lassen sich mit ihrer Hilfe treffen?

Die hydrophobe Konstante dient zur beschreibung der Hydrophobizität einer kleinen molekularen Gruppe R und sie ist definiert durch:

Hierbei ist S das Verhältnis der Löslichkeit des Gemisches R-A in Octanol (nicht polares Lösungsmittel) zur Löslichkeit in Wasser. S0 ist dasselbe Verhältnis für H-A.

Positive Werte für π zeigen Hydrophobizität an, negative Werte bedeuten Hydrophilizität.

Quelle: 01_protein_assembly.pdf, Seite 17

7. Gruppieren Sie die Aminosäuren in folgende 4 Gruppen und skizzieren Sie die Präferenz von Vertretern dieser Aminosäuren für verschiedene Teile der Membran als Funktion der für ihre Insertion benötigten Energie vom Abstand zum Membranzentrum:

• Geladen: KHERD

Skizze: 01_protein_assembly_08.pdf Seite 19 a.)
Sauer: Asp (D, Asparaginsäure), Glu (E, Glutaminsäure),
Basisch: Arg (R, Arginin), Lys (K, Lysin), His (H, Histidin)

• Hydrophob: GALVIP

Skizze: 01_protein_assembly_08.pdf Seite 19 b.)
Gly (G, Glycin), Ala (A, Alanin), Val (V, Valin), Leu (L, Leucin), Ile (I, Isoleucin), Prolin(P)

• Polar: MC QSTN

Skizze: 01_protein_assembly_08.pdf Seite 19 c.)
Ser (S, Serin), Thr (T, Threonin), Cys (C, Cystein), Met (M, Methionin), Glutamin(Q), Asparagin (N)

• Aromatisch: HYPFW

Skizze: 01_protein_assembly_08.pdf Seite 19 d.)
Phe (F, Phenylalanin), Tyr (Y, Tyrosin), Trp (W, Tryptophan), Pro (P, Prolin), Histidin (H, allerdings geladen)

Quelle: 01_protein_assembly_08.pdf Seiten 19-29

Aufgrund des mails vom Pohl, würd ich folgendwermaßen gruppieren: geladen: KERD Hydrophob: VALI polar: MPQGN aromatisch: FHYW dann fehlen noch: Cystein, Serin und Thrionin, die in keinem der Graphen vorkommen. (sunzi)

8. Erläutern Sie den Mechanismus, der zur Sekretion eines Poteins oder zur Insertion des Proteins in die Membran führt!

Skizze: 01_protein_assembly_08.pdf, Seite 18; 02_sec_08.pdf Seite 14;

Anm: siehe auch Frage 1

Die Membran wurde in 3 Zonen eingeteilt (Bulk Water, Interfacial, Hydrocarbon: 01_protein_assembly_08.pdf, Seite 18). Je nach Region gibt es eine unterschiedliche Aufenthaltswahrscheinlichkeit für AS, abhängig von deren Hydrophobizität. Eine Aminosäurenkette wird bei(co-)/nach(posttranslational) ihrer Synthese in den Transloconkanal geleitet. Je nach Hydrophobizität des Segments wird dieses entweder seitwärts in die umgebene Membran entlassen (transmembranale Helix) oder das Peptid wird in das ER-Lumen weitergeleitet.

Um über Insertion oder Sekretion zu entscheiden, scheint das Translocon eine thermodynamische Messung zu machen. Befindet sich ein naszentes Polypeptid im mit Wasser gefüllten Transloconkanal (02_sec_08.pdf, Seite 14). Dieser öffnet sich seitlich und ermöglicht es dem Peptid in Interaktion mit Membran und Wasser zu treten. Ist die Translokationsrate langsam genug, im Vergleich zur seitlichen Öffnung kann sich ein Gleichgewicht zwischen Lipid- und wässriger Umgebung einstellen. Je nach Hydrophobizität bleibt der Proteinabschnitt entweder im wässrigen Milieu und wird ins ER-Lumen weitergeleitet, oder partitioniert in die lipophile Umgebung.

Untersuchungen die zu diesen Vermutungen geführt haben, wurden von Hessa at al. durchgeführt.

Paper: Bowie, Nature Vol.433, 27.Jan.2005, page 367-369

9. Erläutern Sie das der biologischen Hydrophobizitätsskala von Aminosäuren zugrunde liegende Experiment!

Skizze: 02_sec_08.pdf Seite 15 a.)
Um die für eine transmembranale Helix typischen Aminosäure-sequenzen herauszufinden, wurde in die Peptidase Lep, die als Wildtyp zwei membranüberspannende Helices (TM1 und TM2) und eine große Domäne im ER-Lumen (P2) hat, ein künstliches Segment eingefügt (H) und an den Flanken dieses Segments zwei Abschnitte, die glycosyliert werden können (G1 und G2). Wird das H-Segment nun in die Membran eingebaut, wird nur G1 glycosyliert (weil sich G2 im Cytoplasma befindet, und dort keine Zucker an ein Protein angehängt werden), befindet sich H im ER-Plasma, werden sowohl G1 als auch G2 glycosyliert.
Über eine SDS-PAGE kann einfach überprüft werden, ob und wie oft ein Protein glycosyliert ist: Die Zucker erhöhen das Molekulargewicht und führen zu einer geringeren zurückgelegten Strecke bei der Elektrophorese und diskreten Banden (Abb. b.: weißer Punkt: unglycosyliert; ein bzw. zwei schwarze Punkte: einfache bzw. doppelte Glycosylierung ).
Der Grad des Membraneinbaus kann berechnet werden, indem man den Anteil der einfach glycosylierten Proteine f_1g durch den Anteil der einfach und doppelt glycosylierten Proteine f_2g dividiert:

Wir können auch eine Gleichgewichtskonstante K_app angeben, die das Verhältnis von einfach und doppelt glycosylierten Peptiden angibt: K_app = f_1g / f_2g

und von dieser Konstante auf die freie Enthalpiedifferenz ΔG_app schließen:
ΔG_app = − RTlnK_app

Die freien Enthalpiedifferenzen wurden für sämtliche Aminosäuren bestimmt, indem als H-Segment folgende Sequenz verwendet wurde: GGPG-(n*L,(18-n)*A,X)-GPGG mit n~2-6 (auf Grund experimenteller Einschränkungen abhängig von X) und X der zu testenden AA, platziert an der mittleren Position; Die Sequenz wurde verwendet, da sich n*L,(19-n)*A mit n~5-6 bekanntermaßen relativ gut in die Membran integriert, und das Verfahren mit jener Sequenz gewissermaßen normiert wurde. Somit ergibt sich eine biologische Hydrophobizitätsskala (Isoleucin ist am liebsten in der Membran, Asparaginsäure hingegen im Plasma).

Quelle: 02_sec_08.pdf, Seiten 15-18 & ausgearbeiteter Fragenkatalog
Paper: Hessa et al., Nature (2005) 433:377-81

Anm.: Das mit dem Abschnitt H: zum besseren Verständnis empfiehlt sich das Bild auf s. 15 in Kap 2. (sunzi)

10. Welche Mechanismen der Topologieevolution von Membranproteinen sind Ihnen bekannt? Nennen Sie Beispiele! Was versteht man unter dynamischen Topologien von Membranproteinen?

Topology Evolution:

• Mechanismus 1:
  

Skizze: 03_porin_08.pdf Seite 12: Abb.a)
In Organismus 1 codiert Gen X ein (teilsymmetrisches) Protein X, das sich in zwei möglichen Orientierungen in der Membran befinden kann, sich bevorzugt paarweise antiparallel einbaut. Im weiterentwickelten Organismus 2 ist Gen X dupliziert (Gen Xa, Gen Xb), wobei nun beide Gene je ein Monomer mit spezifischer Richtung codieren (Inverse-Topology Protein X). In Organismus 3 schließlich sind die homologen Gene Xa und Xb zum Gen Xa-Xb verschmolzen. Dieses Gen codiert das fusionierte Protein X.

• Mechanismus 2:
  

Skizze: 03_porin_08.pdf Seite 12: Abb.b)
Um die Orientierung eines Proteins umzukehren, dessen N-Terminus sich ursprünglich im Cytoplasma befand, kann z.B. ein Signalpeptid angefügt werden. Dieses Signalpeptid wird nach Membraninsertion abgespalten und der N-Terminus bleibt auf der Zellaußenseite. Ein Beispiel hierfür sind der K+-Kanal (N-Terminus innen) und der Glutamatrezeptor (N-Terminus außen)

Dynamische Topologien:
Die Topologie eines Membranproteins ist nicht immer mit dem Einbau festgelegt; es kann sein, dass es zu Umorientierungen kommen kann/muss: dynamische Topologie.

• Beispiel AQP1:
  

Skizze: 03_porin_08.pdf Seite 13
Bei AQP1 liegen nach der Insertion TM4 und TM2 noch außerhalb der Membran. Damit sich diese Helices in die Membran einbauen können, muss TM3 umorientiert werden.

• Beispiel Hepatitis B Virus Large Envelope Glycoprotein:
  

Skizze: 03_porin_08.pdf Seite 13
Nach Insertion des Proteins liegt TM4 noch nicht in der Membran und auch der N-Terminus "muss" erst posttranslational über die Membran gebracht werden. Dies geschieht allerdings nur in 50% der Fälle.

• Beispiel Hepatitis C Virus E1-E2-p7 Polyprotein:
  

Skizze: 03_porin_08.pdf Seite 13
Hier werden die TM Helices nach und nach eingebaut. Das Protein liegt als lange Kette im Translocon vor, und wird zwischen den Einzelteilen geschnitten. Diese enzymatische Reaktion führt zu 2 Transmembran-Proteinen (E1, E2) und einem sekretorischen Protein (p7)

Quelle: 03_porin_08.pdf Seite 13 & Mitschrift
Paper: Heijne, Nature Reviews, Molecular Cell Biology, Vol.7, page 915 (kein Zugriff)

11. Wie unterscheidet sich die ER-Proteintranslokation von der bakteriellen Proteintranslokation?

• Bakterielle Translokation:

Skizze: _01_protein_assembly_08.pdf, Seite 31. Abbildung A
Bakterielle Translokation benötigt ATP und das elektrochemische Potential der Membran. Bakterielle Translokation ist im Gegensatz zur ER Translokation nicht an Translation gekoppelt. Entweder Chaperone (rot) oder eine Besetzung der C-Terminus durch den Ausgangstunnel des Ribosoms (blau) verhindern eine Faltung des Preproteins. An die Membran gebundene Rezeptoren (grün) binden diese Preproteine und bringen sie ins Translocon. Vom Translocon wird das Preprotein über die Membran gebracht. "Motoren" und Chaperone (gelb) komplettieren den Vorgang.

• ER Translokation:

Skizze: 01_protein_assembly_08.pdf, Seite 31: Abbildung B
ER Translokation benötigt lediglich Nucleotides. Ein Signal Recognition Particle (SRP) koordiniert Translation und Translocation durch binden an eine Signalsequenz und verlangsamen des Kettenwachstums. An der Membran dockt das SRP am SRP-Rezeptor an, das Ribosom wird so zur Membran gezogen. Der SRP-Rezeptor mit SRP und Ribosom wandert zum Translokationskanal. Durch Bindung von GTP an SRP und Rezeptor wird Polysom und naszente Kette zum Sec61-Komplex transferiert und die Translation und Translokation kann weitergehen.

Quelle: 01_protein_assembly_08.pdf Seiten 31-37 & Mitschrift
Paper: Wickner, Schekman, Science, 2005, Vol.310, Page 1452-1456

12. Skizzieren den Ablauf der co- und posttranslationalen Proteintranslokation!

• Co-Translationale Proteintranslokation:

Skizze: 01_protein_assembly.pdf, Seite 35
SRP dockt an Signal-Sequenz im Ribosom an. An der Membran dockt das SRP am SRP-Rezeptor an, das Ribosom wird so zur Membran gezogen. Der SRP-Rezeptor wandert nun mit dem gesamten Komplex zum Translokations-Kanal. Eine Signal-Sequenz dockt am Kanal an, das SRP löst sich ab. Protein wird quasi in den Kanal „hinein synthetisiert“ . Nach vollzogener Translokation löst sich das Ribosom wieder ab.

• Post-Translationale Proteintranslokation (Eukaryont):

Skizze: 01_protein_assembly.pdf, Seite 36
Das Protein wird im Cytosol synthetisiert. Durch cytosolische Chaperone wird das Protein an dessen „Spitze“ eine Signal-Sequenz hängt zum Translokationskanal (Sec61 complex) gebracht. Ein Chaperon (BiP) hilft nun bei der Translokation. Diese erfolgt unter Verbrauch von ATP.

• Post-Translationale Proteintranslokation (Bakterium):

Skizze: 01_protein_assembly.pdf, Seite 37
Hier tritt SecB an die Stelle der cytosolischen Chaperone und SecA an die Stelle des BiP.

Quelle: 01_protein_assembly.pdf, Seiten 35-36
Paper: Rapoport, Nature, 2007, Vol. 450, Page 663-669

13. Erläutern Sie das multimere und das monomere Modell des Translokationskanals. Welche experimentellen Fakten sprechen für jedes dieser Modelle?

• Multimeres Modell:

02_sec_08.pdf Seiten 2, Abb. a-c)
„Front to Front“: Der Transport erfolgt zwischen den beiden Proteinen (SecYEG1, SecYEG2). In der „Closed Protein Conductin Channel“ (closed PCC) Konfiguration, sind die Kanäle durch ein einen Plug verschlossen (a). Wird nun eine Schleife eines entstehenden Proteins (hairpin loop of nascent protein) mit einem Transmembran-Segment (TMS, grün) und einem hydrophilen Segment (orange) eingebracht, wird SecY geöffnet, der Plug verschwindet und die Pore ist geöffnet (b). Das Ribosom führt allerdings wieder zu einer Änderung der PCC Konfiguration: Das TMS wird seitlich aus der SecYEG1 Pore gelassen, diese wird wieder durch einen Plug verstopft (c)
Für dieses Modell spricht ein für ein Protein zu kleiner Porendurchmesser von ~8Å. (?)

• Monomeres Modell:

02_sec_08.pdf Seite 7-8
„Back to Back“: In diesem Modell erfolgt der Transport innerhalb des Proteins. Der Pore-Ring hält hierbei die Pore dicht, während das Protein durch transportiert wird (dicht gegenüber z.B. H+). Im closed State ist auch hier die Pore durch einen Plug (kurze, beweglich gelagerte α-Helix) verstopft.
Für dieses Modell spricht die Disulfidbrückenbildung zwischen passenden Cystein-Mutanten des SecY und dem transportierten Polypeptid. Diese Brückenbildung (durchscannen des C) lokalisiert die Pore im Zentrum des SecY

Quelle: 02_sec_08.pdf Seiten 2-8
Papers:

• Rapoport, Trends in Cell Biology, Vol.14, No.10 Oct. 2004
• Cannon et al., J. Cell Biol. 169 (2): 219-225, 2005

14. Wie wird gewährleistet, dass der Translokationskanal impermeable für kleine Moleküle ist (zwei Modelle!)

Johnson Modell:
Skizze: 02_sec_08.pdf Seite 26

• Mit Durchmesser von 9-15Å ist Pore für Translokation zu klein, also geschlossen. Um Impermeabilität für kleine Moleküle zu gewährleisten wird die Pore durch BiP abgedeckt.
• Öffnet sich der Kanal zur Translokation (40-60Å) löst sich auch BiP ab, die Impermeabilität wird durch aufsetzen des Ribosoms weiter gewährleistet.
• Löst sich das Ribosom wieder ab, muss BiP den Kanal wieder verschließen.

Rapoport Barrier Modell: Skizze: 02_sec_08.pdf Seite 30
Im ungeöffneten Zustand wird die Impermeabilität für kleinere Moleküle durch den Pore-Ring sowie durch den Plug gewährleistet. Im offenen Zustand verhindert der Pore-Ring das Durchdiffundieren von kleineren Molekülen und Ionen. Hierbei bleibt der Plug, bis das Protein zur Translokation bereit ist. Plug Mutationen (Prl Phenotype) zeigen, wenn der Plug zu früh entfernt wird, wird das Protein verkehrt herum in die Membran eingebaut.

Vollzieht man eine Plug-Deletion kann die Bildung eines neuen Plugs beobachtet werden, die Zelle überlebt. Lediglich eine Mutation mit Plug-Deletion und einem Ersetzen aller 6 Lysine lässt keine Zelle überleben. (Biophysik IV, Prof. Martin Spiess, Biozentrum Universität Basel)

Quelle: 02_sec_08.pdf, Seiten 26-30

15. Was versteht man unter "hydrophobic gating"? Führen Sie Beispiele an!

Unter hydrophobic gating versteht man ein Öffnen oder Schliessen des Kanals, das nicht von sterischer Occlusion abhängt, sondern von den hydrophoben Eigenschaften der Kanalwand.
Bei manchen Kanälen (Nikotin-Acetylcholin-Rezeptor; bakterielle, mechanosensetive Kanäle) gibt es in den engsten Stellen des Kanals hydrophobe Reste. Bei einem Nikotin-Acetylcholin-Rezeptor scheint der Kanal physisch Offen zu sein, auch wenn er funktionell Geschlossen ist.
Generell kann man sagen, dass die Pore geschlossen erscheint, wenn keine Wassermoleküle in der Pore-cavity sind, und offen wenn Wasser mit der ungefähren bulk-density in der cavity zu finden ist. Der Übergang zwischen offen und geschlossen geht aprupt von statten, wenn die Pore auf einen kritischen Radius ausgedehnt wird. Dieser kritische Radius hängt von der länge der Pore und dem Radius des Porenzugangs ab.

Referenz: Beckstein et al., Phys. Chem., 2001, 105, 12902-12905

16. Wie wurde die Existenz des Translokationskanals im ER mit elektrophysiologischen Techniken nachgewiesen? Skizzieren Sie das Experiment!

Elektrophysiologisches Experiment: Skizze: 03_porin_08.pdf, Seite 4 Ein Bad, gefüllt mit 50mM Salzlösung wird durch eine Lipid-Bilayer Membran in 2 Kompartimente getrennt. In jedem der beiden Kompartimente befindet sich eine Elektrode. Ins cis-Kompartiment (rechts) wurden RM (rough microsome) Vesikel gegeben, diese fusionierten mit der Membran. Die cytosolische Seite liegt nun auf der Seite des cis-Kompartiments. Die trans-Seite entspricht der luminalen Seite des ER.
Über die cis-Kammer ist also die cytosolische Oberfläche der RMs mit ihren angehafteten Ribosomen zugänglich. Zugabe von 100 µM Puromycin zur cis-Seite der Membran verursachte einen großen Anstieg der Membranleitfähigkeit, vermutlich ein Resultat der pyromidininduzierten Termination der in der Synthese befindlichen Proteinketten in den Translocationskanälen (die nacher aus dem Kanal ausgeschieden wurden) . Wird Pyromicin in geringen Dosen zusgegeben (0,33 µM) werden Einzelkanäle mit einer Leitfähigkeit von 220 pS beobachtet. Diese schließen sich, wenn die Salzkonzentration so weit angehoben wird, dass sich die Ribosomen von der Membran ablösen (150-400 mM). Dies lässt vermuten, dass die angehafteten Ribosomen den Kanal in einer offenen Konformation halten. Daher gibt es Hinweise für einen Mechanismus eines kompletten Zyklus von offenen und geschlossenen Translokationskanälen.

Quelle: 03_porin_08.pdf, Seite 4
Paper: Simon, Blobel(1991) Cell 65:371-80

17. Was versteht man unter Caged-Compounds? Geben Sie ein Beispiel für ihre Verwendung an!

Bei Caged-Calcium handelt es sich um Ca^{2 +} -Ionen, die mit einem Molekül derart komplexiert sind, sie befinden sich also in einem Cage,so dass sie keine physiologische Wirkung haben. Erst ein kurzer Lichtblitz (UV-Impuls) zerstört die Bindungen des Kalzium zu seinem Cage und Ca²⁺ wird frei.
Durch diese Methode kann die Zugabe von Kalzium durch einen Lichtblitz genau getriggert werden. So kann zum Beispiel in einer Zelle oder in einem Vesikel eine bestimmte Kalziumkonzentration gleichförmig eingestellt werden kann, ohne durch Diffusion zeitlich behindert zu werden.

Quelle: 03_porin_08.pdf, Seite 19

18. Erklären Sie das Prinzip der Fluoreszenzmikrophotolyse zur Flussmessung durch Kanäle!

Abbildung 03_porin_08.pdf, Seite 20

Um den Transport von Kalziumionen zu messen, werden Ghosts hergestellt, die den Ca²⁺-Fluoreszenzindikator CG (Calcium Green) und Caged-Calcium enthalten. Die Erythrocyten sind sehr gut im Lichtmikroskop sichtbar (a.), kaum jedoch im konfokalen Fluoreszenzbild (b.). Es wird außerdem soviel Aerolysin zugegeben, sodass genau 1 Pore pro Zelle zustande kommt. Durch einen Lichtblitz wird das Kalzium aus dem Komplex gelöst, was zu einem sofortigen Anstieg der Fluoreszenz in den Ghosts führt (c). Mit der Zeit nimmt die Fluoreszenz jedoch wieder ab (d.–f.), da nur das Kalzium durch die Poren aus dem Lumen transportiert werden kann, nicht aber CG.

19. Vergleichen Sie das Matrixporin und das Maltoporin!

Matrixporin und Maltoporin sind die ersten OMPs (outer membrane proteins), die entdeckt wurden.

• Das Matrixporin (auch als OmpF bezeichnet) formt eine nichtspezifische Pore, welche die Diffusion von kleinen, polaren Molekülen (Molekulargewicht kleiner als 600 Da) begünstigt; es ist spannungsabhängig und mäßig kationenselektiv. Die Transportgeschwindigkeit ist linear proportional zur Substratkonzentration.

• Das Maltoporin(auch LamB genannt) erlaubt die Passage von kleinen Nährstoffen durch sein molekulares Sieb, insbesondere von Maltose und maltosehaltigen Oligosacchariden (Maltodextrine). Maltoporin besitzt ein paar Loops, die in den Kanal schauen, dadurch wird die Pore kleiner und es entsteht dieses "molekulare Sieb"; die Transportgeschwindigkeit zeigt eine Michaelis-Menten-Sättigungscharakteristik. LamB weist AS auf, die H-Brücken mit Zucker bilden (03_porin_08.pdf, Seite 33). Diese WW bestimmen Affinität und Spezifität, der Kanal ist selektiv.

Beide Porine sind ähnlich gebaut: Innerhalb der Aminosäuresequenzen, die die β-Stränge formen, alternieren Seitenketten, die einer Umgebung mit niedriger Dielektrizitätskonstante (einer unpolaren Umgebung -- der Membran) ausgesetzt sind, und Aminosäurereste, die zur Innenseite des Barrels hin orientiert sind und die Kanalwand auskleiden. Loop 3 jedes Proteins kann sich in den Kanal biegen und so das Lumen verschließen. 03_porin_08 S. 23

Beide Proteine kommen in der Membran nur als Homotrimer vor; aufgrund zusätzlicher β-Stränge ist ein Maltoporin-Monomer im Vergleich zum in der Draufsicht elliptischen Matrixporin-Monomer nieren- oder bohnenförmig erweitert. Loop 3, die sich in der Nähe der zentralen Ebene der Membran befindet, unterteilt das Barrel in zwei Kompartimente: Den eigentlichen, wassergefüllten Kanal und ein Kompartiment zwischen L3 und der Kanalwand, welches mit Seitenketten erfüllt ist. Im Maltoporin tragen noch zusätzlich drei Loops zur Verengung des Kanals bei: L1 und L6 aus der selben Untereinheit, und L2 der benachbarten Untereinheit. Daher ist der Querschnitt des Maltoporins mit einer Fläche von 5x5 Å viel kleiner als jener von Matrixporin (7x11 Å). Dieser Umstand ist hauptsächlich für die fünffach verringerte Leitfähigkeit des Maltoporins verantwortlich (0,15 nS im Vergleich zu 0,85 nS). 03_porin_08 S. 24

20. Erläutern Sie den Selektivitätsmechanismus im Maltoporin! Gehen Sie dabei insbesondere auf die engste Stelle im Kanal (constriction site) ein!

In der Abbildung auf 03_porin_08 S. 32 ist das Barrel durch weiße Linien angedeutet; die aromatischen Reste scheinen in einem helixförmigen Pfad über die Engstelle des Kanals angeordnet zu sein, mit einer Biegung, die der von Maltodextrin vergleichbar ist greasy slide. Der Pfad wird aus drei Tryptophan- (W420, W358; W74 aus L2 der benachbarten Untereinheit) und zwei Tyrosinresten (Y6, Y41) gebildet. Dieser sogenannte greasy slide bei und verbessert so die Geschwindigkeit des Transports.

Neben diesen aromatischen Aminosäuren (hellblau im Bild auf ebenda S. 33) wird der Weg eines Maltodextrins auch von mehreren sauren und basischen Resten beidseitig ausgekleidet (R8, D116, R33, H113 auf der einen Seite, R82, E43 und R109 auf der anderen). Alle diese Reste (gelb-blau) sind in einer Entfernung zum Maltodextrin, die die Bildung von Wasserstoffbrücken (weiße Linien) mit allen Hydroxygruppen des Zuckers ermöglicht (zwei Oligosaccharide sind gelb-rot gezeichnet). Diese Wasserstoffbrücken bestimmen Affinität und Selektivität des Maltoporins. (Im Hintergrund ist der greasy slide eingezeichnet)

21. Erklären Sie die Strom-Spannungs-Charakteristik des Matrix Proteins von Escheria Coli!

Matrixporin zeigt eine eigenartige Strom-Spannungscharakteristik (03_porin_08 S. 34): Die große Kurve wurde aufgezeichnet, indem an eine Membran mit Matrixporin die auf der Abszisse eingezeichnete Spannung angelegt und der elektrische Strom gemessen wurde.

Im Bereich zwischen −140 mV und +140 mV blieb der sofort nach dem Anlegen der Spannung fließende Strom konstant (lineare Charakteristik), bei höheren oder niedrigeren Spannungen fiel der anfangs beobachtete Strom (strichlierte Linie) aber mit der Zeit ab, bis er einen Gleichgewichtszustand erreichte (durchgezogene Linie mit negativer Steigung).

Aus dieser Kurve erkennt man, dass eine an den Kanal angelegte Spannung das Zustandsgleichgewicht der Kanäle, die zwei Zustände (offen und geschlossen) annehmen können, in Richtung der geschlossenen Kanäle verschiebt, ein Beobachtung die negativen Widerstand und Inaktivierung bei hohen Potentialen erklärt.

22. Welche Exportwege für Proteine durch die äußere Membran von negativen Bakterien sind Ihnen bekannt?

Da die äußere Zellmembran von Bakterien durch die in ihr vorkommenden Lipopolysaccharide sehr unpermeabel ist, existieren zumindest drei Transportwege, über welche Proteine vom Zellinneren bis über die äußere Membran gelangen:

• Typ I umfasst den Transport über einen ABC-Transporter (ABC steht für ATP binding cassette), der über ein Membranfusionsprotein an ein OMP gekoppelt ist.
• Typ II besteht aus einem Sec-Protein und vielen Hilfsproteinen, die das Protein vom Periplasma ins Exoplasma bringen.
• Typ III ist an der Sekretion (oder Injektion) von Proteinen in Tier- oder Pflanzenzellen beteiligt; er ist noch weitgehend unerforscht.

(selber nix dazu gefunden, deswegen das alte übernommen.)

vgl. (vermutlich) bp2_01_33

vgl. 01_protein_assembly_08.pdf S. 33

23. Wie können Sie den Transport von Antibiotika durch Outer-Membrane-Proteins elektrisch verfolgen? Skizzieren Sie den Versuchsaufbau und das zu erwartende experimentelle Ergebnis!

Neuere Untersuchungen lassen darauf schließen, dass die Ladungsverteilung im Antibiotikummolekül genau zur Ladungsverteilung in der Engstelle des OMP passt, wodurch das Antibiotikum besser über den Kanal transportiert werden kann. Diese Übereinstimmung ist sogar groß genug, dass das Molekül für einen Moment so stark an die das Proteinlumen auskleidenden Seitengruppen bindet, dass dies als kurze Blockade des Kanals in einer Stromkurve (wie auf Folie 38 gezeigt) aufgezeichnet werden kann (diese vermuteten Matrixporin-Ampicillin-Intermediate sind auf Folie 39 gezeigt).

• Auf Folie 38 oben ist als Kontrollexperiment der elektrische Strom durch Matrixporin in einer ampicillin-(AP-)freien Lösung gezeigt: Alle drei Untereinheiten sind durchgehend geöffnet, die Bewegung der Ionen wird weitestgehend von der Geometrie und den Oberflächeneigenschaften der Pore bestimmt.
• In der mittleren Abbildung ist die AP-Konzentration so gewählt, dass eine der OmpF-Untereinheiten spontan von einem durchwandernden AP-Molekül geblockt wird. Wird die Zeitachse vergrößert, so erscheinen diese Blocks nicht mehr als Spitzen, sondern als Stufen, die den Strom auf 2/3 des Ausgangswerts absenken.
• Die untere Kurve schließlich wurde bei noch höheren AP-Konzentrationen aufgezeichnet, sodass manchmal auch zwei Untereinheiten gleichzeitig geblockt wurden (sichtbar als Stufen, die den Strom auf 1/3 der ursprünglichen Stärke senken).

24. Bitte erläutern Sie, wie Sie mit Hilfe der Rauschanalyse sowohl Amplitude als auch Anzahl der Kanäle bestimmen können!

Die Zufallsvariable n kann beliebige Werte annehmen (). Für einen einzelnen Kanal (m = 1) ist n entweder 0 oder 1, der Mittelwert ist gleich der Öffnungswahrscheinlichkeit p:

Verallgemeinert auf den Fall m > 1 erhalten wir

,

woraus für die relative Fluktuation folgt:

oder, wenn p klein gegen 1 ist:

und die Amplitude dann

Die Anzahl der Kanäle berechnet sich aus Einzalkanalleitfähigkeit, der Öffnungswahrscheinlichkeit und Gesamtleitfähigkeit der Membran:

.

25. Welchen strukturellen Gegebenheiten sind für Selektivität und hohe Transportrate der K+-Kanäle verantwortlich?

• Selektivität: Der Kanal ist zum einen durch seine Größe selektiv, es können also nur kleine Ionen durch. Warum aber nur Kalium und das kleinere Natrium nicht? Um durch den Kanal zu können müssen die Ionen dehydratisiert werden (Kaliumion ist von 8 Wassermolekülen umgeben), die Dehydratationenergie ist für Kalium wesentlich geringer. Innerhalb des Kanals werden diese Wassermoleküle durch Carbonylgruppen ersetzt. Der Abstand zwischen Carbonylgruppen und Kaliumion (Cage-Size) ist dabei von großer Wichtigkeit (~2.85 Å). Dieser Abstand wäre zu Natrium-Ionen zu groß.

• Transportrate: Eine mit Wassergefüllte Höhle im Kaliumkanal setzt die Born-Energie (durch Veränderung der Dielektrizitätskonstante und Radius (vgl. Übung)) herab, die ein Ion überwinden muss, welches vom extra- oder intrazellulären, wässrigen Medium in die Membran partitionieren will. Des weiteren wird der Transport dadurch begünstigt, porenbildenden Helices insgesamt 8 negative Ladungen tragen, dass der Selektivitätsfilter aus 20 Carbonylgruppen besteht, deren negativ polarisiertes Dipolende (die Sauerstoffe) in Richtung der Pore schauen, und dass dieser Kanal nur 10 Å lang ist. Ein weiterer Vorteil des KscA Kanals sind seine 4 Helices, welche 4 Dipolen entsprechen.

Quelle: 04_ksca1_08.pdf, Seiten 23-26

26. Erläutern Sie den Kalium-Transportzyklus im Selektivitätsfilter!

Wir gehen davon aus, dass jede der vier Positionen im Selektivitätsfilter entweder mit einem Ion oder mit einem Wassermolekül besetzt sein kann, und dass zwei Ionen durch mindestens ein Wassermolekül getrennt sein müssen (da sonst die elektrostatische Abstoßung zu groß wird). Damit sind insgesamt acht Zustände möglich (Abb. 04_kcsa1_08 Seite 32;a)). Die Pfeile auf diesem Bild zeigen die Zustandsänderung durch eine Bewegung der gesamten Ion-Wasser-Kette (durchgezogene Linien) oder durch einen Ionen-Wasser-Austausch an den Enden des Filters (gestrichelte Linien). Zwischen B (1,3-Konfiguration) und C (2,4-Konfiguration) befinden sich zwei Pfeile, weil der Übergang zwischen diesen Zuständen entweder konzentrationsunabhängig durch Bewegung der Wasserkette oder konzentrationsabhängig durch ein Ion erfolgen kann, welches den Filter an der einen Seite betritt, worauf ein Ion an der anderen Seite den Filter verlässt. Jede Zwischenstufe erfordert dabei, dass ein Ion nur von sechs Sauerstoffatomen koordiniert wird, wovon zwei von den Wassermolekülen über und unter dem Ion bereitgestellt werden.

27. Was versteht man unter dem so genannten „induced fit“ beim KcsA?

Der Selektivitätsfilter des Kaliumkanals zeigt die interessante Eigenschaft, dass er eine relativ hohe Kaliumkonzentration benötigt, um seine Konformation aufrecht erhalten zu können. Bei niedrigen Konzentrationen deformiert sich die Struktur, der Kanal kollabiert. Im kollabierten Zustand ist ein Kaliumion zwischen zwei Bindungsplätzen verteilt. Betritt jedoch ein zweites Ion den Kanal, geht KcsA vom kollabierten wieder in den leitenden Zustand über, in dem zwei Ionen über vier Bindungsplätze verteilt sind. Dass der Kanal kollabiert, wenn nur ein Ion im Selektivitätsfilter gebunden ist, kann auch daran gesehen werden, dass hypothetisch die Gesamtenergie, die durch die Bindung eines zweiten Ions am Filter frei wird, nur aus der Bindungsenergie besteht; beobachtet wird jedoch, dass die frei werdende Energie kleiner als die Bindungsenergie ist, da ein Teil von ihr in Arbeit umgewandelt wird, die die Filterstruktur wiederherstellt (induced fit).

04_ksca1_08.pdf, Seiten 38-39

28. Schätzen Sie ab, um welchen Betrag die energetische Barriere im Kaliumkanal durch die wassergefüllten Kammer (Radius = 5 Å) gesenkt wird?

Die freie Energie (Born-Energie), die aufgewendet werden muss, um ein Ion aus dem die Membran umgebenden Wasser in eine Höhle des Radius R zu transportieren, wobei die Höhle die Dielektrizitätskonstante εw hat und die Umgebung der Höhle die niedrige Dielektrizitätskonstante εm, ist gegeben durch

Nach dieser Gleichung errechnet sich die freie Energie zu 16,2 kcal/mol, wenn ein K ⁺ -Ion (und damit eine positive Elementaradung) aus einer wässrigen Umgebung in eine wassergefüllte runde Höhle (R = 5 Å, ε_w = 80) gebracht werden soll, die von Kohlenwasserstoffen (ε_m = 2) umgeben ist. Würde man das Ion (eine positive Elementarladung, Ionenradius = 1,33 Å) direkt in die hydrophobe Umgebung transferiert, müsste eine Energie von mehr als 60 kcal/mol aufgewendet werden.

Die Höhle stabilisiert daher das Ion durch Verteilung seiner Ladung auf ein größeres Volumen, welches als größeres R in die Born-Energie eingeht, um mehr als 40 kcal/mol.

Frei nach Beispiel 12 (9) der Übungen, die rechnen hier mit Ionenradius, ich hab den Atomradius verwendet, ist fast doppelt so groß also ist der Einfluss reziprok proportional. Außerdem wurden hier kcal verwendet und ich habs mit Joule so wie sich das für einen Techniker gehört gemacht

29. Der Kalium- oder Rubidiumionenfluß durch Kaliumkanäle steigt nicht linear zur Ionenkonzentration an. Erläutern Sie diesen Aspekt!

[04.32b] Der Fluss durch einen Kaliumkanal gehorcht einer Michaelis-Menten-Kinetik; das Kalium geht naturgemäß viel leichter durch den Kanal, das Rubidium weist schon bei geringen Konzentration eine Sättigung auf. Im Selektivitätsfilter gibt es ja nur vier Bindungsstellen für Ionen, und die Bewegung von Bindeplatz zu Bindeplatz erfolgt nur mit endlicher Geschwindigkeit (ebenso die De- und Rehydratisierung der Ionen am Kanaleingang und -ausgang).

30. Beschreiben Sie ein Experiment zur Bestimmung der Flusskopplung in Kaliumkanälen!

bp2_04_41-43 single-file ionen im kanal (Konzentration c)

jetzt einfach das Verhältnis der Flüsse J für verschiedene angelegte Spannungen V und verschiedene Konzentrationen c messen, am einfachsten mit Patch-Clamp oder meinetwegen über rekonstituierte Membran, dann logarithmisch plotten, ist n der Kopplungsfaktor aus der Steigung ablesbar.

Der Kopplungsfaktor beschreibt, wie viele Plätze des Kanals im Durchschnitt vom Ion besetzt sind.

31. Wie lässt sich die Leitfähigkeit eines einzelnen Kaliumkanals für Wasser bestimmen?

Um die Einzelkanalwasserpermeabilität zu berechnen, wurde die Gesamtleitfähigkeit G der Membran bei steigender Anzahl von in die Membran eingebauten Kanälen gemessen, und gleichzeitig aus den entsprechenden Konzentrationsprofilen die Gesamtpermeabilität P_f berechnet. Im Diagramm in der rechten Abb. (Folie 5.5) stellt die schwarze Linie das Konzentrationsprofil von Mg²⁺ bei einer kanalfreien Membran allein aufgrund des osmotischen Wasserflusses dar; die farbigen Linien entstanden von oben nach unten bei 8300, 17000, 25000, 36000 und 45000 rekonstituierten Kanälen.
Im kleinen Diagramm ist G gegen P_f,c aufgetragen (um diese Menge von Punkten zu erhalten, wurden natürlich noch mehrere solcher Messungen durchgeführt), aus dem Anstieg der Ausgleichsgeraden kann man die Einzelkanalpermeabilität für Wasser berechnen, die mit p_f = 4,8 · 10⁻¹² cm³/s ca. 100-mal so hoch wie jene von Aquaporinen ist, obwohl diese auf Wassertransport spezialisiert sind.

Diese Einzelkanalpermeabilität ergibt sich nach der Formel: Hierbei sind P_f,c die Wasserpermeabilität über den KscA Kanal (P_f,c=P_f-P_f,l, wobei P_f gesamt, P_f,l über Lipid Bilayer), g entspricht der Einzelkanalleitfähigkeit, A ist die Membranfläche.

Ebenso ist sie 20-mal größer als die Permeabilität, welche aufgrund der Diffusionslimitierung durch eine zylindrische Pore berechnet wird (p_f = 2 · 10⁻¹³ cm³/s).
Die Permeabilität erlaubt die Berechnung der Anzahl M_w von Wassermolekülen (turnover number), die pro Sekunde durch die Pore strömen: Mw = 1,6 · 10¹¹ /s. Die Anzahl der Kaliumionen, die aus der maximalen Einzelkanalleitfähigkeit berechnet wurde, liegt im Vergleich dazu bei M_K = 10⁸ /s.

32. Welche Experimente haben zum Strukturmodell des offenen KcsA Kanals geführt? Skizzieren Sie die Strukturveränderungen, die vonstatten gehen müssen, damit der Kanal vom geschlossenen zum offenen Zustand übergeht! Beschriften Sie die kritischen Aminosäurenreste!

Aufgrund der aufgeklärten Kristallstrukturen des offenen MthK- und geschlossenen KcsA-Kanals sowie aufgrund der Analyse der KcsA-Aminosäurensequenz wird vermutet, dass die inneren vier Helices in einer geraden (anscheinden entpannten) Konformation vorliegen können; in diesem Fall bilden sie ein Bündel, das die Pore in der Nähe der intrazellulären Öffnugn verschließt (Abb. rechts; Folie 5.15 und 5.17). Die inneren Helices können sich aber auch beugen und das Bündel zu einer Öffnung mit dem Durchmesser von ca. 12 Å aufbiegen.

Die strukturelle Eigenschaft, die diese Konformationsänderung ermöglicht, ist die Anwesenheit einer gating hinge in Form eines Glycinrestes tief im Inneren der Membran. Die Aminosäure an der engsten Stelle der intrazellulären Pore (5 AS C-terminal vom Glycin) ist außerdem ein konserviertes Alanin oder Glycin: Seine kleine Seitenkette ragt in Richtung der Pore und behindert aufgrund ihrer Größe den Ionenfluss nicht.

Die konformationellen Änderungen sind zwar sehr groß, aber auf die intrazelluläre Hälfte des Kanals beschränkt. Aufgrund der in allen K⁺-Kanälen hochkonservierten AS-Sequenz glaubt man, dass das Öffnen in allen diesen Kanälen ähnlich vor sich geht.

33. Wie lässt sich der inaktivierte Zustand des Kaliumkanals nachweisen? Welche Interaktionen innerhalb des Kaliumkanalproteins sind für die Inaktivierung verantwortlich?

Der Kanal öffnet bevorzugt bei sauren pH-Werten um 4. Im Experiment wurde mittels einer patch clamp-Pipette eine Membran mit einem sehr hohen Proteinanteil plötzlich von einer leicht basischen Umgebung (pH 7,5) in eine saure gebracht (pH 4, Vorgehensweise s. kleine Zeichnung in der rechtehn Abb. bzw. 5.21). Dadurch konnte das makroskopische Schaltverhalten des KcsA-Kanals (also der Gesamtstrom durch viele Kanäle, keine Einzelmolekülmessung!) untersucht werden.
Man erhielt eine Strom-Zeit-Kurve wie in der Abb. rechts (Folie 5.21) gezeigt; sie ist einerseits durch die sehr schnelle Öffnung der Kanäle und andererseits einen Abfall des elektrischen Stroms gekennzeichnet, wobei sich der Strom auf 5–10 % des Spitzenwerts senkte.
Das Sinken des Stroms liegt aber nicht an derjenigen Konformationsänderung, die den Kanal schließt (also das Zusammenklappen der beiden langen transmembranalen α-Helices), wie eine EPR-Messung (EPR steht für electron paramagnetic resonance, also Elektronenspinresonanz) am Spinsonden-markierten Kanal zeigte: Die Spinsonde saß am 116. Aminosäurerest (der normalerweise ein Glycin ist, aber durch ein Cystein ersetzt wurde, um die Markierung zu ermöglichen) und lieferte verschiedene Signale, je nachdem, ob die vier Helices nahe beieinander waren (geschlossene Konformation, schwarze Kurve), oder ob sie weit voneinander entfernt waren (offene Konformation, rote Kurve).
Da das EPR-Signal beim pH-Wert 4 auf weit voneinander entfernte α-Helices deutete, schloss man daraus, dass der exponentiell fallende Strom nicht daraus resultierte, dass die Kanäle die geschlossene Konformation annahmen, sondern dass sie an einer anderen Stelle im Protein inaktiviert wurden.
Um den genauen Ort der Inaktivierung zu finden, wurde ein pore-loop alanine scan durchgeführt. Das bedeutet, dass der Reihe nach jede Aminosäure des porenbildenden Abschnitts durch ein (funktionsloses) Alanin ersetzt wurde (im oberen 3D-Modell rechts (Folie 5.24) als gelbe Kugeln dargestellt). Von einer Mutation jener AS, die für die Ionenleitung zuständig sind (d.s. die Reste 74–81), wurde jedoch abgesehen; sie sind im oberen Teil als schwarze Kugeln dargestellt. Anschließend wurden die Stromkurven dieser mutierten Kanäle aufgezeichnet (im unteren Teil der rechten Abb. wiedergegeben).
Wie auch der Wildtyp-Kanal zeigen die meisten dieser Mutanten eine geringe Öffnungswahrscheinlichkeit, lange geschlossene Intervalle und mittlere Öffnungszeiten zwischen 5 und 30 ms. Es wurden jedoch drei Mutanten identifiziert, die von diesem Verhalten drastisch abwichen, nämlich R64A, E71A und Y82A, von denen E71A die signifikanteste Abweichung zeigte, nämlich eine Öffnungswahrscheinlichkeit zwischen 95 und 99 %.
Somit dürften das Arginin an Position 64, die Glutaminsäure an Position 71 und das Tyrosin an Position 82 eine wichtige Rolle bei der Inaktivierung spielen.
Um herauszufinden, ob sich die große Steigerung der Öffnungswahrscheinlichkeit in der E71A-Mutante in der Konformation ihres Selektivitätsfilters wiederspiegelt, wurde die dreidimensionale Struktur von E71A über Röntgenbeugung bestimmt. Der mutierte Kanal kann im Bereich des Selektivitätsfilters zwei Konformationen annehmen, da durch die kurze Alaninseitenkette anstelle der längeren Glutaminsäureseitenkette ein „Loch“ entsteht (in der Elektronendichte-Darstellung schwarz strichliert eingekreist). In diesen Hohlraum kann die Seitenkette der Asparaginsäure an Position 80 hineinklappen. Vielleicht ist diese große Umorientierung der Grund dafür, dass das Rückgrat der Reste 75–81 große Positionsänderungen zeigt.

34. Welche Kraft treibt die Inaktivierung? Verdeutlichen Sie diese in einem Schema! Beschreiben Sie die zugrunde liegenden Experimente!

bp2_6_7,8

Die Inaktivierung geht auf die Wechselwirkungen zwischen je einem Trp, einem Asp und einem Glu zurück. Vorstellen kann man sich das als Feder-Wechselwirkung, die den offenen Kanal in die desensibilisierte Stellung zieht. Experimentelle Untersuchung erfolgt mit passenden Mutanten und einer schnellen pH-Änderung (teilweise bp2_5_26). Bei manchen Mutanten erkennt man nun schnellere, bei manchen langsamere Inaktivierung. (vgl. auch Frage 33)

35. Welche strukturellen Modelle existieren zur Erklärung der Spannungsabhängigkeit des KvAP Kanals? Erläutern Sie diese!

• Früher ging man vom konventionellen Modell der Spannungsabhängigkeit aus, bei dem sich die Sensorladungen auf α-Helices befinden, die sich unabhängig von anderen Proteinsegmenten innerhalb eines kleinen Kanals („canaliculus“) bewegen (Abb. rechts bzw. Folie 8.2, Bild a).
• Im neuen Modell (welches aufgrund der Röntgenstruktur postuliert wurde) bewegen sich die Sensorladungen (Bild b, rote Pluszeichen) durch die Membran, indem sich das Sensorpaddel, auf dem sie sitzen, gegen die Membran bewegt.
• Wieder andere Experimente postulieren, dass die Bewegung des Spannungssensors wie ein Transporter erfolgt, wobei sich die äußerste S4-Position wie ein enges Tor verhält, welches äußere und innere Lösung trennt.

36. Das Paddelmodell des KvAP geht davon aus, dass der Spannungssensor großräumige Bewegungen ausführt. Beschreiben Sie die funktionellen Experimente, mit denen dieses Modell untermauert wurde!

Man fertigt spezielle Antikörper, die an die Paddeldomäne binden; die Fab-Fragmente dieser Antikörper werden entweder der extra- oder intrazellulären Lösung einer mit KvAP bestückten Membran zugegeben, und können nur binden, wenn das Paddel von der Membranoberfläche aus zugänglich ist.
Werden die Fab-Fragmente auf der Kanalinnenseite zugegeben, passiert gar nichts (blaue Kurve, Folie 6.16): Selbst wenn der Kanal geschlossen ist, und sich das Paddel auf der Membraninnenseite befindet, liegt es dennoch quer in der Membran und ist von außen nicht zugänglich.
Sind die Fab-Fragmente jedoch extrazellulär, so kann der Kanal zwar öffnen (Paddel bewegt sich auf die Außenseite), aber dann bindet sofort Fab an das nun zugängliche Paddel. Man würde nun erwarten, dass der Kanal nicht mehr schließt; die rote Kurve zeigt jedoch, dass kurz nach dem Öffnen kein Strom mehr fließt. Dies kann durch eine Inaktivierung des K⁺-Kanals bei länger anliegender Spannung erklärt werden (die gleiche Inaktivierung zeigen ja KcsA).

Ein ähnlicher Zugang bedient sich der Biotin-Avidin-Wechselwirkung: Eine Aminosäure im Sensorpaddel (eine funktionell unwichtige!) wird durch ein Cystein ersetzt, an welches über ein Linkermolekül Biotin gebunden wird; dieses kann von einem Avidin gebunden werden, was Auswirkungen auf die Kanalfunktion hat.
Viele Aminosäuren im Sensorpaddel wurden zu einem Cystein mutiert, Biotin angehängt und die Reaktion auf interne und externe Avidinzugabe überprüft. Wenn man die Aminosäurereste einzeichnet, die nur von der extrazellulären Membranseite aus zugänglich sind und durch Avidinbindung den Kanal inhibieren, außerdem die Reste, die nur von innen zugänglich sind, und die Reste, die von beiden Seiten Avidin binden können, erkennt man, dass das Sensorpaddel große Distanzen über die Membran zurücklegen muss.
Fazit dieser Studien: Das Sensorpaddel bewegt sich 15-20 Å.

37. Erläutern Sie mindestens drei verschiedene experimentelle Ansätze, aus denen folgt, dass der Spannungssensor im KvAP nur kleine Distanzen zurücklegt!

• Bindung von Hanatoxin. Hanatoxin (HTX) bindet an den Spannungssensor und bewegt sich mit ihm während der Aktivierung und Deaktivierung (HTX hat dabei eine höhere Affinität für die ruhende als für die aktivierte Konformation). Man untersuchte, wie weit HTX in die Membran eintauchte, um an den Sensor in der ruhenden Konformation zu binden. Dazu wurden die Lipide der Vesikel, in welche KvAP eingebaut war, an unterschiedlichen Stellen ihrer Fettsäureschwänze mit Bromatomen markiert. HTX besitzt an der am tiefsten in das Lipid eintauchenden Stelle ein Tryptophan, dessen Fluoreszenz durch nahe Bromatome abgeschwächt wird (quenching). Die größte Abschwächung fand statt, wenn sich Trp und Bromatome am nächsten befanden, was der Fall war, als das Brom ca. 8,5 Å vom Membranzentrum entfernt war. Fazit: Bewegung von ca. 8 Å.
• FRET-Analyse. Dipicrylamin (DPA) fluoresziert nicht selber, fungiert aber als FRET-Akzeptor für einen an S4 befestigten FRET-Donor und verringert somit dessen Fluoreszenz. Aufgrund seiner negativen Ladung sammelt sich DPA auf der positiv polarisierten Membranseite. Ist die Polarisation nun so, dass der Kanal geschlossen ist, d.h. das Paddel sich jedenfalls auf der einen Seite befindet, befindet sich DPA weit entfernt vom Donor an S4 an der gegenüberliegenden Seite; es gibt kein Donor-Quenching. Wird die Membran-Polarisation nun geändert, wandert das DPA auf die andere Seite. Je nachdem, wie weit sich das Paddel im Schaltvorgang bewegt, erhält man nun entweder FRET (kleine Bewegung) oder kein FRET (große Bewegung, dass die beiden wieder gegenüberliegende Seiten einnehmen). Fazit: Bewegung "um einen kleinen Betrag".
• LRET-Messung. LRET steht für luminescence resonance energy transfer und stellt eine Variante zum FRET dar. Der Akzeptor war an die Rückseite eines porenblockenden Toxins gebunden (dieses sitzt an einer bekannten Stelle in der Mitte des Kanals), der Donor bestand aus einem lumineszenten Terbium-Chelat, das an verschiedene Positionen des Spannungssensors gebunden war. Fazit: Bewegung um ca. 2 Å.
• Wiederherstellen von Torladungen. Die Torladung, die durch Mutation des ersten Arginins in S4 zu einem Cystein verloren geht, kann über eine thiolreaktive Verbindung, die an ein Cystein gebunden wird, wiederhergestellt werden. Aufgrund der variablen Länge des Linkers zwischen Cystein und Ladung können Aussagen über die Sensorbewegung getroffen werden. Fazit: Bewegung von 4 bis 8 Å.

38. Erläutern Sie die Verwendung von Elektronspinsonden zur Strukturaufklärung von Membranproteinen!

Die Position mancher Kanalteile kann mittels Elektronenspinresonanz ermittelt werden. Dabei wird eine Spinsonde (Strukturformel auf Folie 7.15; wichtig ist das Sauerstoffradikal mit dem ungepaarten Elektron) kovalent an einen Cysteinrest gebunden; je nach Umgebung ändert sich das Resonanzsignal, wodurch Rückschlüsse auf die Lage der Spinsonde und somit auch auf die Lage des zugehörigen Aminosäurerestes gezogen werden können.
Das Diagramm links auf Folie 7.16 zeigt die ESR-Signale der markierten Aminosäurereste in der S1-Membran. Die ähnliche Gestalt der Kurven und die Lage ihrer Peaks lässt darauf schließen, dass das S2-Segment wie erwartet sehr rigide ist und kaum Bewegungen ausführt; die Signale der S4-Helix (auf dieser Folie nicht gezeigt) deuten hingegen auf eine große Beweglichkeit dieses Peptidabschnitts.
Die ESR-Messung liefert genau genommen drei verschiedene Paramter: Neben der bereits erwähnten Beweglichkeit der Sonde (als ΔHo⁻¹ abgekürzt) auch die Zugänglichkeit von Sauerstoff (ΠO₂) und von einem Ni²⁺-Chelat-Komplex (Π_NiEdda) zur Sonde.
Zusatzinformationen: Diese Parameter wurden für sämtliche Aminosäuren im Kanal bestimmt und in den drei auf Folie 7.17 gezeigten Diagrammen aufgetragen (auf der Abszisse befindet sich jeweils die Position in der Kette).
Die einzelnen transmembranalen Abschnitte können dabei sehr gut getrennt werden (die Aminosäuren, aus denen sie aufgebaut sind, werden an der Diagrammoberseite durch farbige Linien markiert); diese verbindenden Loops sind nämlich sehr beweglich (Peaks im oberen Diagramm) und haben eine hohe Zugänglichkeit für Wasser (bzw. das extra- und intrazelluläre Medium und den darin gelösten Ni²⁺-Komplex).
Für die transmembranalen Domänen ist eine Steigung der Beweglichkeit und des Sauerstoffzugangs von S1 nach S4 (dort ist das Maximum) typisch.
Die Orientierung der transmembranalen Segmente wird überprüft, indem die Zugänglichkeits- und Beweglichkeitsdaten vektoriell dargestellt werden. Bei S1 sind die Summenvektoren beinahe ein Nullvektor, was darauf hin deutet, dass S1 zur Gänze von anderen Proteinteilen umgeben ist; bei S2 sind sie hingegen lang und zeigen in die gleiche Richtung, nämlich zur Kontaktfläche mit der Lipidmembran.
Die Vektoren von S3a und S3b sind auch in Phase (Abbildung B auf Folie 7.20). Die Helix S4 ist hingegen zweigeteilt in S4a und S4b; diese beiden Abschnitte sind gegeneinander um den Winkel von 90° verdreht (Abbildung D), wie man anhand der Summenvektoren sieht (Abbildung C).

39. Welche Experimente liegen dem „Transporter-like“ Modell des KvAP Kanals zugrunde?

Es gibt experimentelle Daten, die gegen das Vorliegen eines Sensorpaddels sprechen. Wird das erste Arginin in S4 eines nichtleitenden und nichtinaktivierenden Shaker-Kanals durch Histidin ersetzt (R362H), so entsteht eine Protonenpore, die leitet, wenn die Zelle hyperpolarisiert wird.

Herrscht ein einwärts gerichteter Protonengradient, so strömen bei Hyperpolarisation Protonen einwärts, wobei die Stromstärke unabhängig vom Ruhepotential (Vergleich Abb. a und b im linken Teil der rechten Abb. bzw. auf Folie 7.21) ist und in weiten Bereichen linear vom Hyperpolarisationspotential abhängt (Abb. c). Somit gehorcht der Protonenstrom dem Ohmschen Gesetz, was typisch für eine Pore ist.

Die Leitfähigkeit (Abb. d) erfährt eine starke Steigung bei −10 mV und ist zwischen diesem Potential und −100 mV hauptsächlich spannungsabhängig, und zwar spiegelbildlich zur Spannungsabhängigkeit der Torladungen (Abb. a im rechten Teil der rechten Abb. bzw. auf Folie 7.22).

Die Protonenleitung lässt sich folgendermaßen erklären: Das Histidin (grauer Kreis in Abb. e auf Folie 7.22; auch Abb. c) ist nur dann den Protonen im intra- und extrazellulären Medium zugänglich (und „leitet“ somit H⁺), wenn der Kanal die geschlossene Konformation annimmt (links, bei Hyperpolarisation der Fall); in der offenen Konformation (bei Depolarisation) ist R362H hingegen nur von außen zugänglich (rechts).

In Abb. b&d auf Folie 7.22 ist das Verhalten von der R365H-Mutante zu erkennen, die als Spannungs-abhängiger Protonen-Transporter fungiert, und eine gänzlich andere Charakteristik zeigt.

40. Erläutern Sie die Cross-Link-Versuche, die zum minimalen Modell des Schaltvorgangs in spannungsabhängigen Kaliumkanälen geführt haben.

Es wurden zwei vorher als relevant identifizierte Isoleucine an S1 und S2 zu Cystein mutiert, ebenso wie das extrazellulärste Arginin an S4. Es wurde beobachtet, dass in beiden Fällen durch Spannungsimpulse kein Stromfluss verursacht wird; es kommt zur Bindung von Disulfidbrücken, die den geschlossenen Zustand stabilisieren. Zur Bestätigung, dass es sich um S-S Bindungen handelt, wurde DTT zugegeben (löst sehr spezifisch S-S Brücken), und es konnte wieder Strom als Antwort auf einen Spannungspuls gemessen werden. Durch Zugabe von H2O2, das S-S Brücken wiederherstellt, wurde der Strom wieder unterdrückt. Diese Experimente zeigen einen Abstand der AAs von < 1.5 nm an (~max Abstand für S-S Brücken).

Um den Abstand weiter einzugrenzen, wurde zu einer mit DTT behandelten Cystein-Mutante (S4, S2) Cd2+ dazugegeben. Auch hier konnte bei höheren Konzentrationen eine Blockade des Stroms beobachtet werden. Somit kann man folgern, dass sich die beiden AAs bei Hyperpolarisation sehr nahe (< 0.8 nm) kommen.

41. Erläutern Sie Bolztmann-Theorie der Spannungsabhängigkeit von Kanälen!

Die Spannungsabhängigkeit kann, wie viele andere Vorgänge auch, durch einen Boltzmann-Ansatz erklärt werden. Wir gehen davon aus, dass es genau eine offene und eine geschlossene Konformation gibt. Diese werden durch die Gleichgewichtsreaktion

dargestellt, wobei wir im folgenden für die Konzentrationen bzw. Häufigkeiten der offenen und geschlossenen Konformation kurz O und C schreiben wollen. Unter der Annahme, dass in Abwesenheit eines Membranpotentials die offene Konformation um den Betrag w energiereicher ist als die geschlossene, beschreibt eine Boltzmann-Verteilung das Verhältnis von O zu C:

mit z_q: Anzahl der Torladungen, q_e: Elementarladung, E: Membranpotential, k_B: Boltzmann-Konstante, T: Temperatur. Wollen wir nicht das Verhältnis ausdrücken, sondern die relative Häufigkeit von O, erhalten wir nach einigen Umformungen
.

42. Skizzieren Sie ein Energiediagramm für eine Pore, die prinzipiell zwei Zustände (offen, geschlossen) annehmen kann! Welche Änderung erfährt das Diagramm beim Anlegen einer Membranspannung für den Fall einer spannungsabhängigen Pore. Geben Sie eine mathematische Formulierung für die Fraktion der offenen Kanäle an!

Skizze in der rechten Abb. (Folie 6.35/6.37). Angenommen, die Konformationsänderung vom geschlossenen zum offenen Zustand hat das gezeigte Energieprofil, dann ist E_C die Energie der geschlossenen, E_O jene der offenen Konformation und E_B die Energie des Übergangszustandes. Ein angelegtes Potential verändert sowohl E_B als auch E_O, nicht aber E_C Die Raten α und β lassen sich durch eine Arrhenius-Gleichung als Funktionen der Temperatur darstellen:

(A ist eine für die Reaktion typische Konstante, die beim Rechnen oft gekürzt werden kann). Sei x nun die Fraktion der offenen Kanäle, dann muss gelten:

mit der Lösung mit und .

entspricht dabei dem Gleichgewichts-Wert der Fraktion.

43. Wie hängt die Geschwindigkeitskonstante der Kanalöffnung oder auch die Geschwindigkeitskonstante der Kanalschließung vom angelegten Potential ab?

Skizze: 06_kvap1_08.pdf, Seite 39
E_B… Barrier Energy, Energie des Aktivierungsberges; E_O…Open State Energy, bei dieser Energie ist der Kanal offen; E_C…Closed State Energy, bei dieser Energie ist der Kanal geschlossen

Die Energiedifferenzen können durch Taylorreihen approximiert werden:
E_C − E_B = Σ_na_n(V_m)ⁿ und E_O − E_B = Σ_nb_n(V_m)ⁿ

Bei der Entwicklung können Terme höherer Ordnung vernachlässigt werden, bleibt:
E_C-E_B=a₀+a₁V_m und E_O-E_B=b₀+b₁V_m

Da es sich bei a₁ und b₁ um Ladungen handelt kann dies folgendermaßen geschrieben werden:
E_C-E_B=Q(0.5+ζ)(V_m-V_C) und E_O-E_B=-Q(0.5-ζ)(V_m-V_O)

Wobei hier Q der „gating charge“ entspricht (Q=ze), ζ ist ein Asymmetriefaktor (-0.5< ζ<0.5) und V_C, V_O sind von V_m unabhängige Konstanten.

Für die Hin- bzw. Rückreaktion gilt:
und

Obige relationen eingesetzt geben nun die Geschwindigkeitskonstanten in Abhängigkeit vom Potential:
und

Quelle: 06_kvap1_08.pdf, Seiten 39-40

44. Nehmen Sie an, bei einer Membranspannung von - 26 mV würden sich 50 % der Kanäle im offenen Zustand befinden. Berechnen Sie die stationäre Öffnungswahrscheinlichkeit für die Membranspannung von - 13 und - 39 mV!

Formel nehmen und einsetzen:

F=96485 C/mol, R=8.31 J/(mol*K), z=1, T=300 K, V_1/2=-26mV

• für V_m=-13mV: ~62%
• für V_m=-39mV: ~37%

Quelle: 06_kvap1_08.pdf, Seite 41

45. Schlagen Sie einen experimentellen Ansatz zur Bestimmung der Torladung vor!

Mittels Single-Channel Patch-Clamp Versuch kann man die stationäre Öffnungswahrscheinlichkeit (x_∞) für verschiedene Spannungen bestimmen. Für ausreichend negative Spannungen lässt sich diese hierbei erhaltene Kurve linearisieren:

Die Gating-Charge kann nun aus der Steigung abgeschätzt werden.

Skizze: 06_kvap1_08.pdf, Seite 43

46. Wie hängt die Zeitkonstante eines Kanals vom Membranpotential ab?

Die Wahrscheinlichkeit für die offene oder geschlossene Konformationen kann durch die "Reaktionen"

beschrieben werden; daraus folgt die Differentialgleichung

(N: Gesamtzahl der Kanäle). Wenn wir die gesamte Gleichung durch N dividieren und den Bruch O(t)/N als relativen Anteil der offenen Kanäle bezeichnen, erhalten wir die inhomogene Differentialgleichung

Die Lösung dieser Differentialgleichung ist

wobei x_∞ der Anteil der geöffneten Kanäle nach unendlich langer Zeit (im Gleichgewicht) ist und durch gegeben ist, x₀ der Anteil der zu Beginn geöffneten Kanäle ist, und τ_x die Zeitkonstante mit darstellt. Die kinetischen Konstanten α und β sind Funktionen des Membranpotentials (s. Frage 43). Quelle: wiki salzburg

47. Was versteht man unter einem so genannten „Tail Current“?

Im Prinzip beschreibt der tail current das Phänomen, dass ein System bei angelegtem Spannungsrechtecksignal erst mit Verzögerung auf dieses reagiert. Das heißt, dass alle von V_m abhängigen Größen mit der Zeitkonstante τ_x auf das Rechtecksignal reagieren, und zwar sowohl beim Anstieg als auch beim Abfall. Dieser Strom, der noch nach V_m = 0 fließt, wird tail current genannt; er wächst mit zunehmendem Leitwert.

Eine Interpretation des tail current hängt mit den Torladungen zusammen: Die Inaktivierung im Natriumkanal wirkt sich auf den Torstrom aus. Dies kann man messen, indem man eine Membran mit Na⁺-Kanälen, die sich bei einem Ruhepotential von −130 mV befindet, auf 0 mV depolarisiert, eine Weile bei dieser Spannung hält und anschließend wieder auf −130 mV bringt (Abbildung A, oben). Die Ströme, die nach dieser De- und folgenden Hyperpolarisation fließen, und zwar auch dann noch, wenn wieder das Ruhepotential eingestellt wird, sind ein tail current. Indem man die Flächen unter dem beiden Peaks der zugehörigen Stromkurve bestimmt, erhält man die Torladung, die sich beim Öffnen und Schließen des Kanals bewegt hat (die Ladung ist ja das zeitliche Integral des Stroms).
Den Ladungspeak bei der Repolarisation kann man in eine schnelle Komponente mit einem Drittel der Gesamtladung, 1/3Q, und eine langsame Komponente mit zwei Drittel der Gesamtladung, 2/3Q, unterteilen. Ob diese Aufteilung gelingt, hängt von der Dauer und dem Ausmaß der Depolarisation ab, d. h. es kann auch passieren, dass die langsame Komponente kaum sichtbar ist und es den Anschein hat, dass sich überhaupt nur mehr ein Drittel der Ladung zurückbewegt.
Abbildung B zeigt die Modellvostellung dazu. Der inaktivierende Teil blockiert die Pore des geöffneten Kanals und verhindert das Zurückkehren einiger ladungstragender Spannungssensorteile an ihren Ursprungsort, wenn der Kanal geschlossen wird. Bild:[1] hab ih in den folien nicht gefunden; Quelle: wiki sb

48. Welche Rolle kommt der Membrandeformationsenergie bei der Inhibierung von Kanälen zu?

Die Membrandeformationsenergie ist entscheidend für die Aktivität von durch Deformation aktivierten Kanälen (z.B. SACs) sowie von durch Dimerisation aktivierten Kanälen wie Gramicidin. Während Gramicidin von einer leicht deformierbaren Membran (geringe Deformationsenergie) profitiert, da die Stabilität des Dimers erhöht wird, öffnen streckungsaktivierte Kanäle in einer sehr flexiblen Membran später oder u. U. gar nicht. Dies nutzt GsMTx4, ein Gift der roten Chile-Vogelspinne - es erniedrigt die Membrandeformationsenergie und inhibiert so SACs in der Zellmembran, ohne in direkten Kontakt mit den Kanalproteinen treten zu müssen. Experiment dazu: Die Vermutung, dass GsMTx4 die Membran an der Kontaktstelle mit dem K⁺-Kanal stört und somit den Kanal inhibiert, wobei eine Bindung an das Protein selber nicht nötig ist, kann man überprüfen, indem man das Schaltverhalten von Gramicidin A in Anwesenheit von GsMTx4 überprüft: Da das Ausbilden des Gramicidin-Kanals mit einer Deformation der Lipiddoppelschicht einhergeht, müsste durch das Toxin die Kanalbildung erleichtert werden. Dies ist auch tatsächlich der Fall: Die Kanalaktivität wird deutlich erhöht, der Strom durch einzelne Kanäle verringert und die Lebenszeit eines Dimers verdoppelt.
Diese Änderungen in der Kanalfunktion resultieren nicht aus einer spezifischen Bindung des Gifts an das Peptid, denn

1. der Drehsinn der Helix hat keinen Einfluss auf die Wirkung des Toxins, und
2. Gramicidine, deren vier Trp-Reste an der Kontaktfläche Lipid-Kanal durch Tyr ersetzt wurden, zeigen kein anderes Schaltverhalten (GsMTx4 befindet sich mit hoher Wahrscheinlichkeit an der Kontaktstelle und würde im Falle einer Bindung an den Kanal mit genau diesen vier Aminosäuren wechselwirken).

Quelle: wiki sb

49. Wie groß ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein Kanal, der zum Zeitpunkt t noch offen ist zum Zeitpunkt t + Δt schließt?

Bei einem Kanal, der zum Zeitpunkt t öffnet, ist die Wahrscheinlichkeit, dass er in einem Intervall Δt schließt, proportional zu dieser Zeitspanne Δt. Diese Wahrscheinlichkeit ist dabei völlig unabhängig von der Zeit, die zuvor vergangen ist (ein Kanal hat kein Gedächtnis). Die Wahrscheinlichkeit beträgt also
Quelle: wiki sb

50. Leiten Sie den prinzipiellen Verlauf einer Überlebensfunktion her und skizzieren Sie diesen!

Herleitung mittels Münzwurf: siehe wiki sb, jedoch unnötig kompliziert.
Wahrschienlichkeit, dass kanal ein Zeitintervall offen bleibt:
S(t + Δt) = S(t)(1 − μΔt)
auf Def. des Diff.qoutienten umformen: woraus folgt:
S(t) = e ^{− μt}
jetzt kann man noch die Offenwahrscheinlichkeit negativ nach der Zeit ableiten und erhält:
p = − dS / dt = μe ^{− μt}
was die Schließwahrscheinlichkeit darstellt.
beides sind also exp. abfallende funktionen.

51. Was ist ein Öffnungsdauer-Histogramm? Wie wird es erstellt? Wie lässt sich die mittlere Öffnungsdauer eines Kanals ermitteln?

Ein Öffnungsdauerhistogramm ist ein Balkendiagramm, bei dem auf der x-Achse die Zeit aufgetragen ist (unterteilt in aufeinanderfolgende Intervalle Δt) und auf der y-Achse die Summe der im Zeitintervall [t, t+Δt] erfolgten Ereignisse (hier die Kanalschließungen). Das Diagramm wird normiert, also jeder Balken wird durch die Gesamtereignisanzahl dividiert, wodurch man die relativen Häufigkeiten erhält.
Um ein Öffnungsdauerhistogramm zu erstellen, liest man aus der Strom-Zeit-Kurve eines Kanals die Breiten (zeitliche Dauer) der Öffnungen (also die Öffnungszeiten) und trägt sie ins Histogramm ein.
Daraus berechnet man die mittlere Öffnungsdauer, indem man eine exponentiell fallende Funktion (oder eine andere passende) über das Histogramm fittet. Bei der Exponentialfunktion ist die mittlere Öffnungsdauer die Zeit, bis zu der die Kurve auf 1/e abgefallen ist (der Paramter µ der Verteilung).
Quelle: wiki sb

Anm.: sofern es exponentiell ist, was es wohl für alle Kanäle "ohne Gedächtnis" ist, ist es deutlich genauer, einfach den Mittelwert der Messwerte zu nehmen, als einen Kurven-Fit zu machen.

52. Vergleichen Sie die Struktur des Selektivitätsfilters vom K und NaK Kanal! Welche Aussagen lassen sich daraus für die Selektivitätsmechanismen der Kaliumkanäle ableiten?

NaK ist ein zu KcsA ziemlich homologer Kanal, der aber keine starke Ionenselektivität aufweist (daher der Name).

bp2_08_27: Bindungsplätze 3 und 4 sind in beiden Kanälen chemisch äquivalent, statt 2 und 1 findet man in NaK auf Grund der dann unterschiedlichen AA-Sequenz (G'Y'GVT vs. G'D'GVT) eine cavity. Interessant in Bezug auf die K-Selektivität ist, dass in NaK Na problemlos an Stelle 3 binden kann (bp2_08_28_a), in KcsA das jedoch nie beobachtet wird. Somit muss die Selektivität struktureller Natur sein, und kann nicht nur durch chemische Effekte (Hypothese: Abstoßung der Carbonylgruppen erzeugt genau solche Abstände, dass K aber nicht Na koordiniert werden kann) verursacht werden.

Quelle: [Shi, Nature (2006) 440, page573]

53. Welche Rolle hat die Flexibilität des Filters für die Kanalselektivität?

Der Kanal muss dem Ion eine Umgebung bieten, dass den Energieverlust durch abstreifen der Hydrat-Hülle minimiert. Wenn die Größe des Kanals da nicht genau passt (um die Wasserstoffatome rund ums Ion vorzutäuschen) muss der Kanal flexibel in der Größe sein um die Hydrat Hülle dennoch nachzuahmen. Ist er inflexibel, kann er das nicht machen und das Ion nicht gut leiten.
Quelle u. Bilder: kap 08, seite 32.

54. Welcher Zusammenhang besteht zwischen mittlerer Hydratationszahl der Ionen im Filter und Kanalselektivität?

Ein kanal mit 8 Carbonyl Binding Sites ist sehr selektiv für Kalium. Wenn die Carbonyl Gruppen durch Wasser ersetzt werden geht die Selektivität verloren.
Quelle: kap. 08 seite 35

55. Benennen Sie wenigsten drei Krankheitsbilder, die durch Mutationen an Aquaporinen verursacht werden! Zeigen Sie dabei jeweils den Mechanismus auf, der zum Ausbruch der Krankheit führt!

Krankheitsbilder: Katarakt (= grauer Star), Sjögren-Syndrom, Diabetes insipidus

• Aquaporine spielen eine wichtige Rolle im menschlichen Auge. Dort wurden bereits fünf verschiedene Aquaporine nachgewiesen, die alle in unterschiedlichen Bereichen vorkommen, so z.B. in der Hornhaut und Tränendrüse. In AQP0 reicht bereits eine falsche Aminosäure aus, dass sich das Protein falsch faltet, wodurch die Augenlinse trüb wird und sich ein Katarakt bildet.
• In den polaren Epithelzellen der Tränendrüse wird AQP5 in der apikalen, AQP3 und AQP4 in der basolateralen Membran exprimiert. Bei Patienten mit dem Sjögren-Syndrom, das sich klinisch durch einen trockenen Mund und trockene Augen äußert, ist AQP5 nicht vorhanden.
• Die Niere enthält eine Vielzahl an Aquaporinen. AQP2 verdient dabei eine besondere Beachtung: Da Aquaporine normalerweise immer offen sind, muss die Wasserleitfähigkeit der Membran über die Anzahl der Aquaporine in der Plasmamembran geregelt werden, was auf hormonellem Weg geschieht.
  Ein Defekt im Aquaporin 2 (es kann nicht zur Plasmamembran transportiert werden) oder im Vasopressin-Rezeptor ist die Ursache für den nephrogenen Diabetes insipidus, ein vermindertes oder fehlendes Ansprechen der Niere auf Vasopressin. Da AQP2 für die letzte Rückresorption in der Niere (ca. 20 L Wasser) zuständig ist, entsteht bei Diabetes insipidus eine Hypertonizität der Körperflüssigkeit durch Verlust von freiem Wasser. Bisher wurde eine Vielzahl von Mutationen in AQP2 entdeckt, die zu Diabetes insipidus führen;

56. Erklären Sie den Selektivitätsmechanismus der Aquaporine, der zum Ausschluss von Anionen, Kationen und Protonen führt!

• Größe
• Anionen Exklusion:Arginin erzeugt starke elektrostatische interaktion mit Backbone Carbonylgruppe. Die resultierende partielle neg. Ladung stoßt Anionen ab.
• Kationen und Protonen Exklusion durch elektrostatsiche Abstoßung: Dipol der Halben Helices, Arginin, NPA Motiv (bp2_09_12). (was auch immer das heißen mag...)

Quelle: kap 09 seite 27.

57. Worin unterscheiden sich orthodoxe Aquaporine von Aquaglyceroproteinen? Skizzieren Sie die Änderungen im Selektivitätsfilter, die zur Änderung der Kanalpermeabilität geführt haben!

Bei Aquaporinen unterscheidet man zwischen zwei Arten, den orthodoxen Aquaporinen und den Aquaglyceroproteinen. Nur bei AQP8 (Ammoniak Transport) ist man sich nicht sicher, ob diese vielleicht einer dritten Gruppe angehören. (s. 09_aqp_08a.pdf, Seite 7)

• orthodoxe Aquaporine: leiten nur Wasser, Skizze: 09_aqp_08a.pdf, Seite 11, A
• Aquaglyceroporin: diese leiten neben Wasser auch noch Glycerin und Harnstoff. Bei diesen Proteinen besitzt die ar/R-Engstelle einen größeren Durchmesser und ist daher auch für größere Moleküle durchlässig. Skizze: 09_aqp_08a.pdf, Seite 11, B

Quelle: 09_aqp_08a.pdf, Seiten 7-14
Paper: Beitz, PNAS (2006) 103: 269-274

58. Aquaporin-2 spielt eine wichtige Rolle in der Regulation des Wasserhaushaltes des Menschen. Erläutern Sie diese!

Die Niere enthält eine Vielzahl an Aquaporinen. AQP2 verdient dabei eine besondere Beachtung: Da Aquaporine normalerweise immer offen sind, muss die Wasserleitfähigkeit der Membran über die Anzahl der Aquaporine in der Plasmamembran geregelt werden, was auf hormonellem Weg geschieht. Vasopressin (auch ADH, Antidiuretisches Hormon) bindet an den Vasopressin-Rezeptor, was über ein G-Protein zur cAMP-Ausschüttung führt. Das cyclische Nukleotid aktiviert eine Phosphokinase, die ein ρ-Protein phosphoryliert. Das ρ-Protein bricht das Aktin-Netzwerk, das die Zellrinde bildet, und erlaubt so den intrazellulären Vesikeln, in deren Membran AQP2 eingebaut ist, das Aquaporin durch Exocytose in die Zellmembran einzubauen. Ein Defekt im Aquaporin 2 (es kann nicht zur Plasmamembran transportiert werden) oder im Vasopressin-Rezeptor ist die Ursache für den nephrogenen Diabetes insipidus, ein vermindertes oder fehlendes Ansprechen der Niere auf Vasopressin. Da AQP2 für die letzte Rückresorption in der Niere (ca. 20 L Wasser) zuständig ist, entsteht bei Diabetes insipidus eine Hypertonizität der Körperflüssigkeit durch Verlust von freiem Wasser.

Quelle: salzburger Wiki; 09_aqp_08a.pdf, Seiten 17-19
Paper: King et al., Nat.Rev.Mol.Cell.Biol. 5: 687-698, 2004

59. Erläutern Sie das Prinzip der Wasserflussmessungen mittels Laser-Scanning-Reflection-Microscopy!

Laser-Scanning-Reflection-Microscopy: Bei dieser Methode wird das an der Grenzfläche zwischen Phasen unterschiedlicher optischer Dichte reflektierte Licht aufgenommen.

Um den Wasserfluss zu messen, beobachtet man eine Änderung des Zellvolumens. Zu diesen Messungen wird der pH-Wert der Umgebung konstant gehalten. Die im Paper von Tsunoda, Wiesner, Lorenz, Rosenthal und Pohl beschriebene Messung erfolgte an HEK293 Zellen. Gemessen wurde an 3 unterschiedlichen Konfigurationen: einer Kontrollzelle ohne AQP1, einer Zelle mit AQP1 und einer Zelle mit YFP-AQP1. Das YFP bindet am N-Terminus des AQP1 und sollte daher die Funktionalität nicht beeinflussen. Zwischen AQP1 und YFP-AQP1 konnte kein signifikanter Unteschied im Anschwellen der Zelle beobachtet werden, bei der Kontrollzelle kam es allerdings zu einer wesentlich geringeren Volumsänderung.

Ein weiteres Kontrollexperiment wurde durchgeführt, um sicher zu gehen, dass das stärkere Anschwellen AQP-bedingt ist: 200µM HgCl₂ wurden der Zellumgebung zugeführt. HgCl₂ wirkt als Inhibitor für Aquaporine. Bei den Kontrollzellen konnte keine signifikante Änderung des Volumens beobachtet werden. Bei den beiden Anderen war nun die Änderung des Volumens und damit der Wassefluss etwa gleich jenem der Kontrollzelle.

Skript: 09_aqp_08a.pdf, Seite 3
Papers:

• Maric, Wiesner, Lorenz, Klussmann, Betz, Rosenthal, Biophys. J. 80: 1783-1790, April 2001
• Tsunoda, Wiesner, Lorenz, Rosenthal, Pohl, J. Biol. Chem 279: 11364-11367, März 2004

60. Nennen Sie Argumente für und gegen eine Rolle von Aquaporinen im Gastransport!

Einen Hinweis auf CO₂-Transport über Aquaporine gab es aus Experimenten an Xenopus oocyten. Es wurden Experimente an Kontrollzellen sowie AQP1 exprimierenden Zellen durchgeführt und ein Anstieg der Rate der "cytoplasmic acidification" um 30-40% nach Zugabe von CO₂. Allerdings konnte an Erythrozyten beobachtet werden dass die CO₂-Permeabilität durch Abwesenheit von AQP1 nicht beeinflusst wird. CO₂ Austausch über epitheliale und endotheliale Barrieren in der Lunge ist ebenfalls nicht von einer Deletion von AQP1 und/oder AQP5 betroffen.¹

Mittels Molecular Dynamics Simulation wurde Versucht die Permeation Barrier von verschiedenen Molekülen durch hAQP1, die Mutante hAQP1-HA/RV und GlpF zu finden. Die Ergebnisse wurden in Diagrammen von Potential Mean Force (PMF) über Abstand zum Mittelpunkt des Porins aufgetragen. In diesen Diagrammen sind Energiebarrieren schön zu erkennen und befinden sich jeweils in der ar/R Region. Ein Vergleichsexperiment für die Permeation von O₂, CO₂, NH₃ und H₂O über POPC und POPE Membranen wurde durchgeführt. Für O₂, CO₂ fand man ein ΔG_max von 6kJ/mol, für Permeation über hAQP1 fand man einen wesentlich höheren Wert (~22-27 kJ/mol). Dies lässt es äußerst unwahrscheinlich erscheinen, dass Aquaporine einen Einfluss auf den Gasfluss über eine Membran haben.²

Diagramme und Werte: Fig.2, Fig.3, Table 1 im Paper von Hub und de Groot

¹ Xiaohui Fang et al., Evidence against aquaporin-1-dependent CO2 permeability in lung and kidney, Journal of Physiology (2002), 542.1, pp. 63-69

²J. S. Hub and B. L. de Groot. Mechanism of selectivity in aquaporins and aquaglyceroporins. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 105 (4):1198-1203, 2008.

61. Erläutern und skizzieren Sie die prinzipiellen Unterschiede im Aufbau von Anionen- und Kationenkanälen!

Für Ionenkanäle gibt es zwei Architekturen:

Skizze: 11_chlor08.pdf, Seite 10

• Die antiparallele Bauweise des ClC-Kanals(Abb. a) beinhaltet strukturell ähnliche Hälften, die in der Membran gegenläufig angeordnet sind (schwarze Pfeile). Diese Architektur erlaubt den gleich polarisierten Helixenden, ins Zentrum der Membran von verschiedenen Membranseiten aus zu zeigen (180° Trennung).
• Die parallele Bauweise von Kaliumkanälen (Abb. b) enthält hingegen ähnliche oder identische Untereinheiten mit der gleichen Membranorientierung (schwarze Pfeile). Die α-Helices zeigen von der gleichen Membranseite aus in die Membranmitte. Die Helices auf diesen beiden Bildern sind als Dipole mit positivem (rot) und negativem (blau) Ende gezeichnet.

Quelle: salzburger Wiki, 11_chlor08.pdf, Seite 10

62. Welche Transportwege kann Wasser durch epitheliale Barrieren nehmen?

• wholly paracellular
• wholly transcellular
• transcellular then paracellular

Es gibt keinen Fluss über die Tight-Junction, solange die "junctional" Permeabilität nicht durch Kinase A drastisch erhöht wird.

Quelle: 10_water_cotransport_08.pdf, Seiten 2-6
Paper: Kenneth R. Spring, Annu. Rev. Physiol., 60: 105-19, 1998

63. Welche Argumente sprechen für einen primär transzellulären Transport? Erläutern Sie die entsprechenden Experimente!

• AQP1 (nützt den Wassergradienten): Ohne AQP1 ist es Knockout-Mäusen nicht möglich, konzentrierten Urin zu bilden, also genug Wasser zu resorbieren. Im Experiment wurden Knockout-Mäuse ohne AQP1 und Kontrollmäuse beobachtet. Nach einem Wasserentzug von 36 Stunden konnten drastische Unterschiede im Bezug auf Körpergewicht (decrease of 35% in knockout mice, decrease of 20-22% in WT-mice) und Urinkonzentration beobachtet werden.¹
  

Grafik zur Urinkonzentration: 10_water_cotransport_08.pdf, Seite 5

• Einfluss des Unstirred-Layer (UL) auf Bestimmung der Wasserpermeabilität: Extrazelluläre UL polarisieren die gelösten Stoffe und wirken so dem osmotischen Gradienten entgegen. Die Dicke der extrazellulären UL kann durch intensives Rühren reduziert werden, ein Problem bereiten dennoch unzugängliche intraepitheliale UL. Aufgrund dieser UL liegen Messungen der transepithelialen Wasserpermeabilität immer unter dem wirklichen Wert.²

• Kein Fluss über die Tight-Junction (TJ) von MDCK Zellen: Um dies zu Zeigen wurde ein Fluoreszenzmarker in den lateral intracellular space (LIS) gefügt. Um Aussagen über den Wasserfluss zu treffen, wurde die Fluoreszenzintensität gemessen. Als Ergebnis ergab sich bei diesen Messungen die Bestimmung der Geschwindigkeit der Flüssigkeitsbewegung im LIS, außerdem gelang eine Messung des "transjunctionalen" Flusses. Dabei kam man zum Schluss, dass es keinen significanten Fluss über die TJ gibt.³ (wurde in der VO nicht durchgemacht)

Quellen:
¹ Ma et al., J. Biol. Chem., Vol.273, 4296-4299, 1998
² Spring, Annu. Rev. Physiol. 60: 105-19, 1998
³ O. N. Kovbasnjuk, J. P. Leader, A. M. Weinstein, and K. R. Spring. Water does not flow across the tight junctions of MDCK cell epithelium. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 95 (11):6526-6530, 1998

64. Wägen Sie die Argumente für oder gegen den sekundär aktiven Wassertransport gegeneinander ab!

Das Konzept von Cotransportern als molekulare Wasserpumpen hat seinen Ursprung in experimentellen Studien über Choroid Plexus. Bei diesen Studien fand man Beweise für Uphill-Wasser Transport, gekoppelt an K-Cl Cotransport.^1,2. Weitere Anzeichen für das Konzept des Wasser-Cotransports wurden in Untersuchungen an einem Modellsyste dem Na-Glucose Cotransporter (SGLT-1) in Xenopus laevis oocyten, gewonnen. Bei diesen Untersuchungen wurden simultan Na-Glucose- und Wasser-Transport nach einer schnellen Veränderung (t_1/2<1s) der extrazellulären Flüssigkeit gemessen. Diese Experimente zeigen, dass der Wasser-Transport, mit einer festen Stöchiometrie von 2Na⁺, 1 Glucose und 210 H₂O direkt an den Na-Glucose Transport gekoppelt ist. Diese Stöchiometrie ist unabhängig von externen Parametern wie Natrium- und Zucker-Konzentration, Membran-Potential, Temperatur oder osmotischen Gradienten.¹
Physiologisch sei zu erwähnen, dass rein durch osmotische Mechanismen der Wasser-Transport für einige epitheliale Zellen nicht erklärt werden kann. Im Darm, wo etwa 10 Liter Wasser pro Tag aufgenommen werden, können keine osmotischen Gradienten im LIS (lateral intercellular space) gefunden werden. Da etwa 1 Mol Glucose pro Tag durch den Darm aufgenommen wird könnten Na-Glucose-Wasser Cotransporter für 4 der 10 Liter verantwortlich sein. Es wird weiters erwartet, dass Na-Aminosäure- und K-Cl-Cotransporter (1K : 1Cl : 500 H₂O) signifikante Mengen Wasser über die epitheliale Plasmamembran transportieren.¹

Ein starkes Argument gegen dieses Konzept ist die unwahrscheinlich hohe Anzahl an Cotransportern. Um den beobachteten Wassertransport mittels Cotransportern zu bewerkstelligen wäre eine Transporter-Dichte von etwa notwendig.¹

Quellen: 10_water_cotransport_08.pdf, Seite 26
¹ Spring, News Physiol. Sci., Vol.14, June 1999
² Zeuthen, J. Physiol., 478, 203-219, 1994

65. Berechnen Sie den maximalen Glukosegradienten, gegen den der SGLT1 Glukose aus dem Darm aufnehmen kann! Gehen Sie von den üblichen intra- und extrazellulären Natriumkonzentrationen aus.

SGLT1 betreibt sekundär aktiven Transport mit 2Na je 1Glukose.

damit das läuft, muss für die freien Energien gelten:

mit Na 150(out):10(in), T=310K (Körpertemp), Membranpotential -70mV erhält man

also SGLT1 kann Glucose von außen nach innen transportieren, so lange die Konzentration innen das ~42500fache der Konzentration außen nicht übersteigt. Mit 1:1-Transport (so wie SGLT2) geht es nur bis zum ~200fachen.

66. Beschreiben Sie das spannungsabhängige Schalten des Chlorkanals ClC0! Skizzieren Sie den Verlauf der Öffnungswahrscheinlichkeit von der angelegten Spannung!

Das Öffnungsverhalten in EcClC ist spannungsabhängig. In Abb. B auf Folie 11.14 wurde der Strom 7 ms nach Aktivierung als Funktion des Ruhepotentials aufgezeichnet und durch die bereits bei den Kaliumkanälen ausführlich behandelte, über Boltzmann-Ansatz herleitbare Fermi-Funktion

ausgeglichen (Skizze vom Verlauf der Öffnungswahrscheinlichkeit). Für die Torladung z erhielt man dabei den Wert 0.92.
Wenn der E148-Rest mutiert wird, zeigt die Glutamin-Mutante beinahe keine anderen Ströme; das Schaltverhalten bei den Alanin- und Valinmutanten ist hingegen völlig anders. Dies erkennt man auch aus Einzelkanalaufzeichnungen: Wird das Glutamat durch ein Alanin substituiert, schließt der Kanal kaum noch. Beim Vergleich der Elektronendichtekarte der E148A-Mutante mit derjenigen des WT-Kanals fällt auf, dass ein Halogenatom an der Stelle sitzt, die normalerweise von der Seitenkette von E148 eingenommen wird. Man vermutet, dass die Pore bei dieser Mutante ständig offen ist, weil sie eine ununterbrochene Kette von Anionen von der extra- zur intrazellulären Membranseite enthält.
NB: Da bakterielle Kanäle nicht elektrophysiologisch untersucht werden konnten, wurde in diesem Experiment auf ClC-0-Kanäle aus dem Zitterrochen zurückgegriffen, die in Xenopus-Oocyten exprimiert wurden. Diese Vorgehensweise erscheint gerechtfertigt, da der Selektivitätsfilter der ClC-Kanäle hochkonserviert ist.

Quelle: salzburger Wiki, 11_chlor08.pdf Seiten 14-16

67. Worin unterscheiden sich die geschlossene und offene Konformation des Chlorkanals?

In der Abbildung in 11_chlor08.pdf, Seite 17 ist eine schematische Zeichnung des offenen und geschlossenen Zustands von EcClC zu sehen. In der geschlossenen Konfiguration (links) sind die Ionenbindungsplätze S_int und S_cen von Chloridionen besetzt, und die Bindungsstelle S_ext ist von der Seitenkette von E148 (rot) ausgefüllt. In der offenen Konfiguration hat sich die E148-Seitenkette aus S_ext in das extrazelluläre Vestibül bewegt, S_ext ist von einem dritten Chloridion besetzt. Die Cl−-Ionen sind als rote Kugeln, die Wasserstoffbrücken als blaue gestrichelte Linien gezeigt.

Quelle: salzburger Wiki, 11_chlor08.pdf, Seite 17

68. Wie wurde nachgewiesen, dass es sich beim Protein ClC - EC1 nicht um einen Kanal, sondern um einen Carrier handelt?

Der Chlorid-Transport in EcClC muss an einen Transport eines zweiten Ions gekoppelt sein. Dies erkennt man aus den Stromkurven in den Abbildungen a und b im oberen Teil der Abbildung auf 11_chlor08.pdf, Seite 18, die bei symmetrischen pH-Werten von 3 (a) und 5 (b) aufgezeichnet wurden. Die zugehörige Strom-Spannungs-Charakteristik in Abb. c zeigt, dass das Umkehrpotential von Cl- bei 30 mV} liegt -- um einiges niedriger als das Nernstpotential von 45 mV. Aus den bei asymmetrischen pH-Werten und symmetrischen Chloridkonzentrationen aufgezeichneten Stromkurven (Abb. d und f) und dem daraus resultierenden I-V-Diagramm (Abb. g) erkennen wir, dass die Stromkurven verschoben sind, und dass das Umkehrpotential nicht wie erwartet 0 mV} beträgt. Die Schlussfolgerung lautet, dass der Kanal für Protonen zumindest bis zu einem gewissen Ausmaß permeabel sein muss, und dass der H+-Transport entgegen dem Cl--Transport (als Antiport) erfolgt. Wenn wir von einem stöchiometrischen Austausch gemäß der Reaktion

ausgehen, wobei n und m stöchiometrische Koeffizienten sind und sich die tiefgestellten Buchstaben auf die intra- und extrazelluläre Membranseite beziehen, berechnet sich das Umkehrpotential Vr nach:

(ECl- und EH+: Nernstpotentiale für Chlorid bzw. Protonen; r: Verhältnis der ausgetauschten Ionen).

Wie hängt das Umkehrpotential vom Chlorid- und Protonengradienten ab?

Das Diagramm a in der Abbildung auf 11_chlor08.pdf, Seite 20 stellt die Abhängigkeit von der (externen) Cl--Konzentration dar (die interne wurde fest eingestellt). Die weißen Kreise entstanden bei einem symmetrischen pH-Wert von 5, die schwarzen Kreise bei pH 3. Die Abszisse ist logarithmisch, um eine bessere Vergleichbarkeit mit Diagramm b zu erhalten. In Diagramm b ist dagegen Vr als Funktion des externen pH-Werts bei gleichen Chloridkonzentrationen gezeichnet. Die durchgezogenen schwarzen Geraden in a und b stellen den besten Fit nach obiger Gleichung mit r = 0.43 dar. Die gestrichelten Linien würden bei einfacher Elektrodiffusion nach der GHK-Gleichung erwartet werden. Der Antiport-Mechanismus sagt außerdem voraus, dass das Umkehrpotential beim simultanen Vorliegen eines pH- und eines Ionengradienten die Summe der Umkehrpotentiale sein müsste, die bei einem einfachen Gradienten gemessen werden; dies ist tatsächlich der Fall.

Quelle: salzburger Wiki, 11_chlor08.pdf, Seiten 18-20

69. Skizzieren Sie den prinzipiellen Aufbau und den experimentellen Verlauf zum Nachweis des chlorgetriebenen Protonentransports!

Die Entdeckung, dass ClC vielleicht ein Antiporter und kein einfacher Ionenkanal ist, veranlasste zu weiteren Versuchen. Wenn ClC als Chlorid-Protonen-Austauscher arbeitet, dann müsste ein errichteter Gradient des einen Ionenpartners den sekundären aktiven Transport des anderen Partners veranlassen. Der zugehörige klassische Versuchsaufbau sieht vor, dass über eine Liposomenmembran ein Cl^--Gradient aufgebaut wird, und der darauf folgende Protonentransport durch pH-Änderung im externen Medium registriert wird.
Im in der rechten Abb. (Folie 11.21) gezeigten Versuch wurde ein auswärts gerichteter Chloridgradient errichtet, wodurch Protonen in die Liposomen transportiert wurden. Der pH-Wert der Pufferlösung änderte sich um 0,02 Einheiten. Obere Kurve: WT-Protein, untere Kurve: E148A-Mutante. Der mit "Val" beschriftete Pfeil bezeichnet die Hinzugabe von Valinomycin -- bis zu diesem Zeitpunkt ist kein H⁺-Transport beobachtbar, da der Transporter die Membran stark polarisiert (3 bewegte Ladungen pro Turnover). Valinomycin (ein K⁺-selektiver Ionophor) sorgt für den ausgleichenden Transport positiver Ladungen über die Membran und ermöglicht so den Cl^- / H⁺-Antiport. Der mit "FCCP" beschriftete Pfeil bezeichnet die Hinzugabe von p-(Trifluoro-methoxy)-phenylhydrazon, einem Protonen-Entkoppler, welcher die Aufnahme von H⁺ rückgängig macht.

Zusatzinformation: Die E148A-Mutante zeigt keinen H⁺-Transport, sie leitet jedoch Cl^- entlang des Konzentrationsgradienten (in getrennten Experimenten nachgewiesen). Daraus folgt, dass E148 für die Antiporter-Funktion von ClC-ec1 verantwortlich ist; die Mutante ist ein einfacher Chlorid-Kanal.

70. Skizzieren Sie den prinzipiellen, experimentellen Aufbau, und erläutern Sie ein Experiment zum Nachweis des protonengetriebenen Chlortranports mit Hilfe von Proteoliposomen!

Im Prinzip ist die Vorgehensweise die gleiche wie bei Frage 69. Da der Austausch-Mechanismus umkehrbar sein muss, wurde bei einem einwärts gerichteten Protonengradienten der Chloridausstrom durch einen Cl^--sensitiven Fluoreszenzindikator (SPQ) bestimmt. Der Antiport dürfte zumindest einen fünffachen Chloridgradienten aufbauen. Oben in der rechten Abb. (Folie 11.22) befindet sich wiederum die Kurve des WT-Proteins, unten diejenige der E148A-Mutante. Zum Grund für die Zugabe von Valinomycin (Val) und p-(Trifluoro-methoxy)-phenylhydrazon (FCCP) sowie der Bedeutung der Mutante E148A siehe Frage 69.

71. Skizzieren Sie die wichtigsten Strukturelemente des Acetylcholinrezeptors und benennen Sie diese!

Der nicotinische Acetylcholinrezeptor nAChR ist ein Pentamer aus zwei α- und je einer β-, γ- und δ-Subdomäne. Jede Untereinheit besteht aus einer großen extrazellulären Domäne, vier Transmembran-Helizes (M1–M4) und einem weitern intrazellulären helikalen Abschnitt (MA) zwischen M3 und M4 (siehe bp2_11_36).

Die extrazelluläre Domäne (10 Faltblätter, 1 Helix, viele Loops) befindet sich größtenteils im synaptischen Spalt und bildet die Bindestelle für den Agonisten; es gibt je eine ACh-Bindungstasche an den Interfaces α-γ und α-δ.

Die genaue Funktion der intrazellulären Segmente ist nicht bekannt, sie bilden gemeinsam mehrere große Zugangs-Fenster zum Kanal.

72. Vergleichen Sie die freien Energien der Konformationsänderungen im gebundenen und freien Zustand des Rezeptors!

siehe Schema bp2_12_8

Um das Protein zu einem Rezeptor zu machen, welcher fähig ist, einen Liganden zu binden, muss die R-Konformation (R für relaxed) mit einer höheren Affinität binden. Diese höhere Affinität erlaubt dem Bindungsvorgang des Liganden, das Gleichgewicht vom ansonsten bevorzugen T- zum R-Zustand zu verschieben (T für tense). Dies bedeutet, dass das zu K₁ gehörende ΔG und das zu K₀ gehörende ΔG₀ unterschiedliche Vorzeichen haben.
Wenn wir vom Zustand T₀ zum Zustand R₁ gelangen wollen, so ist es vom energetischen Standpunkt aus egal, ob wir den Weg über R₀ oder T₁ wählen. Dies drücken wir aus durch

.

73. Der Anteil eines Rezeptors im funktionellen Zustand hängt von der Konzentration des Liganden ab. Bitte geben Sie einen entsprechenden Ausdruck für ein allosterisches Protein mit einer einzigen Bindungsstelle an! Erläutern Sie diesen anhand der entsprechenden Reaktionsgleichung!

Die Antwort V (response) ist der Anteil der Rezeptoren im funktionell aktiven Zustand R:
.

Auf Grund folgender Beziehungen (Massenwirkungsgesetz!)

können wir V auch als Funktion der Gleichgewichtskonstanten ausdrücken:

In Abwesenheit des Liganden wird die R-Konformation sehr selten angenommen werden, der Anteil des aktiven Rezeptors K₀/(1 + K₀) wird daher sehr klein sein. Genauso wird bei einem guten Rezeptor K₁ einen hohen Wert haben und K₁/(1 + K₁) ungefähr gleich 1 sein. So gelangen wir zum Ausdruck

,

der gewöhnlichen Sättigungskinetik, der man bei der Analyse von Enzymen sehr oft begegnet. Die führt dazu, dass man bei einem Rezeptor mit einer einzigen Bindungsstelle im Experiment eine scheinbare Affinität (apparent affinity) K_R*K₀ messen, die (Frage 72) gleich dem Wert K_T*K₁ ist und sich von der tatsächlichen Affinität um den Faktor K₀ unterscheidet.

74. Der Acetylcholinrezeptor hat zwei Bindungsstellen. Wie können Sie mit elektrophysiologischen Experimenten nachweisen, ob beide Bindungsstellen gleichwertig sind?

Die Bindungsstellen haben verschiedene Affinitäten für den Antagonisten Curare. In Einzelkanalstudien werden einfach gebundene Rezeptoren als eine eindeutige Komponente von kurz geöffneten Kanälen wahrgenommen. Doppelt gebundene Rezeptoren bewirken länger andauernde Kanalöffnungen. Wenn die Konzentration des Antagonisten erhöht wird, wächst auch die relative Häufigkeit dieser lange dauernden Öffnungen.

Die Häufigkeit der kurz geöffneten, einfach gebundenen Kanäle erreicht beim Maus-AChR eine Sättigung bei einer Carbachol-Konzentration von 5 mM (Carbachol ist ein Agonist des ACh-Rezeptors). Die Häufigkeit der lang geöffneten, doppelt gebundenen Kanäle wächst hingegen immer weiter und zeigt keine Anzeichen einer Sättigung. Daraus folgert man, dass die zweite Bindestelle eine viel niedrigere Affinität hat als die erste (im mathematischen Modell unterscheiden sich die Affinitäten um den Faktor 100).

Die Raten der Binde- und Dissoziationsereignisse für Acetylcholin bei der geschlossenen Kanalkonfiguration wurden aufgrund der Einzelkanalöffnungszeiten bestimmt. Die beiden Bindeplätze haben dabei verschiedene Geschwindigkeitskonstanten von 0,6 * 10⁸ M^-1s^-1 (Bindestelle 1) und 1,5 * 10⁸ M^-1s^-1 (Bindestelle 2).

(Anm: ich find das experiment von bp2_12_32 viel besser, aber das ist halt leider nicht so elektrophysiologisch...)

75. Wieso unterscheiden sich die zwei Bindungsstellen des Acetylcholinrezeptors in ihrer Affinität zu Acetylcholin?

Im Prinzip könnte dies zwei Ursachen haben:

1. Es gibt intrinsische Unterschiede zwischen den beiden Bindungsstellen; sie hätten dann selbst in dem Fall verschiedene Strukturen, wenn sie unbesetzt sind.
2. Es gibt negative Kooperativität in der Form, dass die Besetzung der einen Stelle die Affinität der anderen verringert; negative Kooperativität beim Binden an die geschlossene Konformation würde bedeuten, dass die Bindeplätze ohne die Hilfe eines allosterischen Übergangs wechselwirken können.

Der wahre Grund kann gefunden werden, indem man AChR-Mutanten herstellt, bei denen die α-Untereinheiten andere als die gewöhnlichen Nachbarn haben. In bp2_12_32 erkennt man, dass die Affinitäten von der benachbarten Untereinheit abhängen, also intrinsisch sind.

76. Zeigen Sie anhand der Bindungsenergien, dass der Acetylcholinrezeptor mindestens zwei Moleküle binden muss, um seine Funktion zu erfüllen!

Acetylcholin hat eine maximal mögliche Bindungsaffinität von ungefähr 10¹⁰ M^-1 (vorgegeben durch die Bindungsenergie von 13,4 kcal/mol); die Affinität des geschlossenen Zustands muss dabei größer als 10³ M^-1 sein, sonst würde der Rezeptor nicht derart schnell von den während der synaptischen Übertragung beobachteten Konzentrationen aktiviert werden.

Die Gleichgewichtskonstante des allosterischen Übergangs kann sich also maximal um den Faktor K_O/K_C = 10¹⁰ M^-1 / 10³ M^-1 = 10⁷ als Resultat eines einzigen Bindungsereignisses verändern.

Die Gleichgewichtskonstante muss für ungebundene Rezeptoren kleiner als 10^-6 sein, um ungewollten Stromfluss in Abwesenheit von Acetylcholin zu verhindern, aber im aktivierten Zustand auch groß genug sein (>10) , um einen signifikanten Strom während der Aktivierung zu ermöglichen.

Dies deutet darauf hin, dass die Besetzung einer einzigen perfekten ACh-Bindestelle gerade genug Energie liefert, um die erforderliche Änderung im Gleichgewicht zwischen offener und geschlossener Struktur zu liefern. Es bliebe also keine Toleranz für Fehler, wenn der Rezeptor nur eine einzige Bindungsstelle hätte.

77. Wie sind Agonistbindung und Kanalöffnung im Nicotinreceptor gekoppelt? Beschreiben Sie ein Experiment zum Nachweis dieser Kopplung!

Die für die Bindung wichtigen Aminosäuren sind in bp2_12_44 vergrößert zu sehen. Sie sind entsprechend ihrer elektrostatischen Ladung eingefärbt: blau, positiv; rot, negativ; grau, neutral; van-der-Waals-Radien sind als graue Gitter eingezeichnet. Die Schlüsselreste stammen vom β-Faltblatt 10 der C-Schleife, dem β1-β2-Linker und dem M2-M3-Linker.

Der Pfad, der zum Öffnen des Kanals nach Ligandenbindung führt, beginnt mit einer als C-Schleife bezeichneten Struktur, die sich der Bindungsstelle nähert, sobald ein Agonist bindet (bp2_12_40). Diese Bewegung setzt sich wahrscheinlich zu der Grenze zwischen Bindungs- und Kanaldomäne über eine Verschiebung des β-Stranges 10 fort. An dessen Ende dehnt sich Arg209 bis in das hydrophobe Innere der Untereinheit aus, wo es auf Glu45 trifft. Dieses und das auf der Kette benachbarte Val46 zweigen vom β1-β2-Linker ab und umschließen Pro272, welches in dem Linker sitzt, der auf die kanalbildene M2-Domäne folgt. Val46 passt auch in die Einbuchtung, die von den Resten Ser269 bis Pro272 gebildet wird.

Um zu überprüfen, ob dieser Pfad stimmt, wurden die genannten wichtigsten Aminosäuren mutiert und der elektrische Strom durch den Kanal gemessen (bp2_12_45). Die R209Q-Mutante führt dazu, dass der Kanal für kürzere Zeiten geöffnet und für längere Zeiten geschlossen ist. Die E45K-Mutante verhält sich ähnlich, was darauf hindeutet, dass diese beiden Reste gleiche Teile zur Kanalsteuerung beitragen und womöglich elektrostatisch wechselwirken.

78. Wie funktioniert die Weitergabe der Information über die Acetylcholine-Bindung an den eigentlichen Kanal, d.h. wie ist die Kanalöffnung an die Ligandenbindung gekoppelt?

siehe Frage 77... (abzüglich Experiment)

79. Welche ATPase Klassen gibt es? Worin unterscheiden sie sich?

Die Einteilung erfolgt sowohl an Hand des Transportmechanismus als auch an Hand der genetisch/strukturellen Homologie.

• P-Klasse: bauen einen Ionengradienten unter Verbrauch von ATP auf; kein Rotor/Stator Prinzip wie F,V,A; z.B. Na-K Antiporter, H-K Antiporter, H-Ca-Antiporter

• F-Klasse: nutzen einen Protonengradienten zum Aufbau von ATP, können aber auch "anders rum" laufen; sind nach Rotor/Stator Prinzip aufgebaut; z.B. F₁F₀

• V-Klasse: bauen einen Protonengradienten unter Verbrauch von ATP auf (eng verwandt mit F-Klasse, können aber nur in dieser Richtung arbeiten); z.B. V₁V₀

folgende nicht aus der VO:

• A-Klasse: F-Klasse Analogon in Archea; z.B. A₁A₀

• E-Klasse: Hydrolysieren extrazellulär verschiedene NTPs und NDPs, darunter auch ATP

[Quelle]

80. Skizzieren Sie den Post-Alberts Cycle für die Ca und die Na/K ATPAse!

Na-K:

3Na binden intrazellulär an die Pumpe -> ATP kann mit einem Glu oder Asp der Pumpe interagieren (Phophorylierung) -> Konformationsänderung -> Na in neuer Konformation nicht mehr stark gebunden, diffundiert in den jetzt zugänglichen extrazellulären Raum -> dafür jetzt hohe Affinität zu K, 2 davon binden -> Hydrolyse des P am Glu/Asp wird induziert -> Konformationsänderung -> wieder geringe Affinität zu K (diffundiert in den intrazellulären Raum) -> hohe Affinität zu Na -> Anfang

Bei Ca genauso (statt nach extrazellulär halt ins ER, 2 Stück davon), nur dass anscheinend nicht ganz sicher ist, ob aus dem ER 2H+ mitgenommen wird oder die Hydrolyse des Asp+P gleich nach dem Abgang vom Ca geschieht.

81. Aus welchen Unterheiten bestehen die P-Type ATPasen? Skizzieren Sie, wie diese Untereinheiten miteinander interagieren um Ionen über die Membran zu pumpen!

Skzze bp2_13_20/21

Nukleotid-bindende Domäne, Phosphorylierungs-Domäne, Motor-Domäne und Transmembran-Domäne; Transmembran- und Phosphorylierungs-Domäne sind relativ starr verbunden.

n Ionen X binden gut koordiniert in der Transmembran-Domäne. Dadurch kommt es zu einer solcherartigen Änderung in der Nukleotid-bindenden Domäne, dass eine Interaktion eines ATP in einer Bindungstasche dieser Domäne für selbiges mit dem Asp/Glu der Phosphorylierungs-Domäne möglich wird. Die Phosphorylierung löst die Konformationsänderung der Motordomäne aus, die wiederum die Konformation der Transmembran-Domäne stark beeinflusst. n Ionen X sind nun nicht mehr so gut koordiniert und diffundieren weg, m Ionen Y binden gut koordiniert. Jetzt das gleiche nochmal nur dass die Hydrolyse begünstigt wird.

(Anm: Irgendwie scheinen sich die Leute nicht einig zu sein, ob das ATP/ADP auch die Reise mitmacht...)

82. Welche der Transportschritte der Na/K ATPase sind elektrogen und wie wurde das nachgewiesen?

Elektrogene Transportschritte:
Skizze: 13_ATPase_08.pdf, Seite 29

• cytoplasmische Bindung von 3 Na⁺ (blau) führt zum Na₃E₁ Zustand und senkt Fluoreszenzintensität.
• extrazellulärer Release der 3 Na⁺ (rot) durch Zugabe von ATP. Das ATP führt in den P-E₂ Zustand, in welchem eine geringe Affinität für Na⁺ vorherrscht.
• extrazelluläre Bindung von 2 K⁺ (grün)

Die Release der beiden Kalium-Ionen auf der cytoplasmischen Seite ist elektroneutral, da die beiden Bindungsstellen von 2 H⁺ besetzt werden(13_ATPase_08.pdf, Seite 33) In der Abbildung auf Seite 33 sind es jene Bindungsplätze, welche innerhalb der Schleife liegen.

Experimenteller Nachweis: Nachgewiesen wurden diese elektrogenen Transportschritte mittels eines Fluoreszenzexperiments. Verwendet wurde der Farbstoff RH421 (13_ATPase_08.pdf, Seite 28)welcher sich ausgerichtet in die Membran einbaut. Bei RH421 handelt es sich um ein elektrochromes Molekül, das heißt, seine Fluoreszenzintensität verändert sich in Abhängigkeit eines äußeren lokalen elektrischen Feldes. So kann durch verfolgen der Fluoreszenzintensität ein Ladungstransfer beobachtet werden.

Quelle: 13_ATPase_08.pdf, Seiten 28-33
Paper: Apell, Biochemistry, 63 (2004) 149-156

83. Führen Sie ein Schema des Transportzyklus der Na/K ATPase an, aus dem die Rolle der Protonen und der Kanalokklusion ersichtlich wird.

Skizze 13_ATPase_08.pdf Seite 38

Unter Kanalokklusion versteht man, soweit ich das aus Apell, Biochemistry 63 (2004) 149-156 entnehmen konnte den Zustand, an dem der Kanal durch zwei Ionen besetzt ist. Bild dazu: [2]

Die meisten Schritte habe ich in Frage 82 sowieso schon erklärt. Hier kann man sehen, dass das Binden von 2 K⁺ auf der rechten Seite elektrogen ist, da beide Bindungsplätze frei sind. Der Releas hingegen ist lediglich ein Tausch von 2 K⁺ gegen 2 H⁺ (linke Seite)

Quelle: 13_ATPase_08.pdf Seite 38
Paper: Apell, J. Rev Physiol. Biochem. Pharmacol.(2003) 150:1–35 (gibt es, aber nicht für uns)

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