VO Einführung in die molekulare Genetik, Prof. Frischauf, Fragenkatalog

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1. Origin of Replication
a) Wieviel origins of replication haben jeweils E.coli, Hefe und Säuger?
bc) Wie kann man experimentell einen replication origin isolieren und charakterisieren?
d) Wie wird in E.coli verhindert, dass ein origin mehrmals pro Zellzyklus verwendet wird?

2.
ab) Wie kann man zeigen, dass ein Protein an ein Stück DNS bindet? Beschreiben Sie zwei Methoden: Prinzip!
c) Wieso kann ein Protein sequenzspezifisch an eine doppelsträngige DNS binden, wo doch die Basen in Basenpaaren bereits in gegenseitigen Kontakten verwendet werden?
d) Gibt es sequenzspezifische Endonukleasen? Geben Sie ein Beispiel!

3. Analyse der Karte eines Gens und Vorhersage von Southern Blot-Ergebnissen
a) Wie groß ist die cDNA, wie groß ist die kodierende Sequenz? (bitte Rechnung aufschreiben)
b) Zeichnen Sie eine Restriktionskarte der vollständigen cDNA. Sie ist so kloniert, dass am Anfang und am Ende je eine HindIII Schnittstelle entstanden ist.
c) Sie machen einen Verdau von genomischer DNS mit EcoRI, trennen die Fragmente am Gel auf und hybridisieren mit der vollständigen cDNA. Was für Fragmente sehen Sie auf dem Southern Blot? (bitte die Rechnung aufschreiben und erklären)
d) Ihr Southern Blot ist nicht schön, Sie sehen die Banden kaum im Schmier. Könnten Sie Ihre cDNA-Probe so modifizieren, dass Sie weniger Hybridisierung haben, die nicht vom analysierten Locus kommt? Wie und warum?

4. Rekombination
a) Was sind die einzelnen molekularen Schritte in der homologen Rekombination?
b) Was ist die Rolle von RecA?
c) Was ist eine Holliday Junction und was passiert dort?
d) Was ist Genkonversion?

1. Transkription und Replikation
a)die durchschnittliche Lebensdauer von eukaryotischer mRNA ist wesentlich länger als von prokaryotischer: weshalb?
b) Was ist ein Promoter, was ist ein Enhancer?
c) Ist Transkription oder Replikation in E.coli schneller (gemessen in Nukleotide/sec)? Warum ist das notwendig?
d) Ist Transkription oder Replikation genauer –gemessen in Fehler/eingebaute Base? Warum ist das wichtig?

2. Speziesvergleiche durch Hybridisierung Sie machen genomische Southern blots mit EcoRI geschnittener DNA aus verschiedenen Spezies: Mensch, Maus, Rind, Krokodil, und Drosophila. Außerdem haben Sie noch mit EcoRI verdaute, klonierte menschliche cDNA aufgetragen. a) Sie verwenden als Sonde einen menschlichen cDNA Klon für ein hochkonserviertes Gen, das im Menschen groß ist und viele Introns besitzt. Sie hybridisieren mit dieser radioaktiven cDNA (beim markieren entstehen relativ kleinere, zufällige Fragmente dieser cDNA). Erwarten Sie in allen DNAs Banden - wenn sie bei Standardbedingungen hybridisieren? Wenn sie die Temperatur verändern? (in welche Richtung) b) Erwarten Sie Banden derselben Größe in den verschiedenen DNAs? Warum? c) Erwarten Sie in der humanen DNA dieselben EcoRI Banden wie bei der verdauten, klonierten cDNA? d) Wenn sie einen radioaktiv markierten genomische Klon des menschlichen Gens mit dem Southern blot hybridisieren. wo erwarten Sie Banden, wo erwarten Sie einen Schmier? (genomische DNA enthält repetitive Sequenzen).


3. PCR
a) PCR ist eine gute Methode um festzustellen, ob eine bestimmte Sequenz, also ein STS in einer DNS vorhanden ist, z.B. in einem YAC Klon. STS-Gehalt-Analyse wurde verwendet um nach Überlappungen zwischen YAC Klonen zu suchen. Wie funktioniert das? Zeichnung!
b) Wenn eine Mutation in der Sequenz aufgetreten ist, die amplifiziert wird, - also zwischen zwei Primern liegt – spielt das eine Rolle für die DNS-Bande, die man dann am Gel sieht?
cd) Wenn eine Mutation von einer oder sehr wenigen Basen in der Sequenz aufgetreten ist, die den Primern entspricht, so kann das zur Verringerung, zum vollständigen Verlust oder auch zu unveränderter Produktmenge führen: Wieso? (Tipp: Position) Wie kann man das eventuell steuern?

4. mehr Transkription und Replikation
ab) Beim Phagen Lambda gibt es Rolling Circle Replication. Was bedeutet das? Was geschieht mit dem Produkt dieser Replikation?
c) Was sind die Eigenarten mitochondrialer DNS-Replikation?
d) Wie wird das Genom von Retroviren vermehrt?

1.
a) Was ist Telomerase? Wie funktioniert sie?
b) Wozu braucht die Zelle Telomerase, was pasiert wenn sie nicht vorhanden ist?
c) Gibt es Telomerase in E.coli? Warum?
d) Warum dürfen in der Zelle keine freien Doppelstrang-Enden vorliegen?

1. Protein-DNS Interaktionen
a) Geben Sie Beispiele für sequenz-spezifische und sequenz-unspezifische DNS-bindende Proteine.
b) Man kann in vitro mit dem Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) die Fähigkeit eines Proteins, an eine bestimmte kurze DNS-Sequenz zu binden, bestimmen. Wie funktioniert das?
cd) DNS Footprinting macht die Bindungsstelle eines Proteins an DNS sichtbar. Beschreiben sie so ein Experiment!

2. DNS-Sequenzierung
a) Was ist das Prinzip der Sanger Sequenzierung?
b) Welche Komponenten müssen in einer Sequenzierreaktion vorhanden sein?
c) Was passiert wenn man 1)zuviel oder 2)zu wenig Didesoxynukleotidtriphosphat zugibt?
d) Die Sequenzierung erfolgt in einer linearen PCR Reaktion - d.h. in vielen Schritten - bei denen nach jeder DNS-Synthese denaturiert werden muss. Wie sieht der zeitliche und der Temperatur-Ablauf der Reaktion aus und wie viel Produkt kann dabei maximal entstehen?

3. Rekombination und Integration
a) Was für Arten von Transposons gibt es?
b) Wie können sich Transposons innerhalb des Genoms bewegen?
c) Was ist site-specific recombination in Lambda?
d) Was ist homologous und non-homologous end joining?

4. Klonierung und Hybridisierung
Sie haben ein Plasmid mit einem vollständigen humanen cDNA insert (d.h. die ganze mRNA ist in dem Klon repräsentiert), und einen cosmid Klon mit dem entsprechenden menschlichen Gen. Ausserdem haben Sie einen cDNA Klon mit dem homologen Gen aus Schimpansen, einen mit dem homologen Gen aus Mäusen, einen mit dem homologen Gen aus Hefe. Sie schneiden alle Klone mit dem Restriktionsenzym EcoRI und lassen die Proben auf einem Gel laufen.
a) Was ist ein cosmid Klon und warum ist das Gen im cosmid kloniert worden?
b) Erwarten Sie, dass die cDNA Fragmente in den verschiedenen Klonen identische Größen haben? Sind welche wahrscheinlich identisch mit den genomischen? Warum?
c) Sie blotten Ihr Gel und hybridisieren mit dem insert des menschlichen cDNA Klons. Bei der Hybridisierung verwenden Sie eine Temperatur, die nahe am Schmelzpunkt eines perfekten Hybrids liegt. Erwarten Sie, dass alle Banden hybridisieren? Warum?
d) Sie machen dieselbe Hybridisierung bei niedriger Temperatur. Bekommen Sie mehr oder weniger Banden? Warum?

1.
a) Was ist Denaturierung von DNS? Was ist Hybridisierung? Was passiert dabei?
b) Wovon hängt die Geschwindigkeit der Hybridisierung ab?
c) Wovon hängt der Schmelzpunkt des Hybrids ab?
d) Sie haben einen Southern Blot von Hühner DNS gemacht und wollen cDNA von einem menschlichen Gen als Sonde zur Hybridisierung verwenden. Wie stellen Sie sicher, dass die Sequenzen, die zwar verwandt aber nicht identisch sind, hybridisieren?

2. Eukaryotische Promotoren
a) Was ist ein Promoter, was ein Enhancer? Was für Elemente enthält er?
b) Wie kann ein sequenzspezifischer Transkriptionsfaktor seine Bindungsstelle erkennen?
cd) Wie kann man in vitro experimentell nachweisen, dass ein Faktor an eine bestimmte DNS-Sequenz spezifisch binden kann?

3. DNS Replikation
ab) Meselson und Stahl zeigten in ihrem Experiment, dass DNS semikonservativ repliziert wird, d.h. dass jeweils ein neu synthetisierter Strang mit einem alten in einer Doppelhelix zusammenkommen. Sie zeigten das durch Dichtegradienten. Phagen wurden in 15N wachsen gelassen (höhere Dichte als 14N), zu Zeitpunkt 0 wurde leichter Stickstoff zugegeben und die resultierende DNS zum Zeitpunkt 0 bzw. nach einer Replikationsrunde und nach 2 Replikationsrunden auf Dichtegradienten aufgetrennt. Zum Zeitpunkt 0 war eine Bande mit der Dichte von vollständig „schwerer“ DNS zu sehen. Wie sah das Resultat nach einer bzw. 2 Runden aus?
c) Warum wird bei der Replikation der zweite Strang in Form von Okazaki Fragmenten polymerisiert?
d) Was für enzymatische Aktivitäten werden in der Replikation gebraucht (z.B. DNS Polymerase – Anhängen eines Desoxynukleotidtriphosphates an 3’ Ende des wachsenden DNS Strangs unter Abspaltung von 2 Phosphatresten – muss nicht alles so ausführlich sein)

4.
a) Was ist eine Genbibliothek, wofür kann man sie verwenden? Welche Eigenschaften soll sie haben?
b) Was braucht man, um eine Genbibliothek zu erstellen?
c) Lambda Vektoren waren lange Zeit das Hauptwekzeug zur Herstellung genomischer Bibliotheken. Was haben cosmid Vektoren mit Lambda gemeinsam, was mit Plasmiden?
d) Was für Elemente sind in YAC Vektoren vorhanden, die für die Verwendung als Klonierungsvektor wichtig sind? (z.B. origin of replication)

Inhaltsverzeichnis

Ausgearbeitete Fragen

VO Einführung in die molekulare Genetik, Prof. Frischauf, Fragenkatalog

1. Origin of Replication

  • a) Wieviel origins of replication haben jeweils E.coli, Hefe und Säuger? E. Coli hat einen Ori (Ori C); Hefe hat mehrere pro Chromosom (beispielsweise Chromosom III – 9 Oris); Säuger haben viele Oris pro Chromosom
  • bc) Wie kann man experimentell einen replication origin isolieren und charakterisieren?
    Beispielsweise bedient man sich dem Hefe Genom. Dieses verdaut man mit DNAse (also einem unspezifischen Enzym), sodass man zufällig geschnittene Hefe-DNA-Fragmente bekommt. Ein solches Fragment wird nun in ein Plasmid eingebracht (mittels passender Restriktionsenzyme und anschließender Ligation durch das Enzym Ligase), welches HIS+ ist – also auch auf histidin-defizienten Medien wachsen kann. Dieses Plasmid wird nun seinerseits in Hefe Zellen eingebracht, die his- sind. Diese werden auf einem histidin-defizienten Nährmedium ausplattiert und inkubiert. Bilden sich mit der Zeit viele Kolonien, so ist dies nicht nur ein Beweis für die erfolgreiche Integration des Plasmids in die Hefe Zellen, sondern auch ein Beweis für die Anwesenheit eines Oris in der zufällig geschnittenen Hefe-DNA, denn die Plasmide replizieren unabhängig vom Wirts-Chromosom (sofern eben ein Ori vorhanden ist). Entstehen mit der Zeit hingegen nur wenige Kolonien, so hat sich die Plasmid-DNA zufällig ins Hefe-Chromosom (=Wirtsgenom) integriert.
  • d) Wie wird in E.coli verhindert, dass ein origin mehrmals pro Zellzyklus verwendet wird? Was könnte passieren, wenn das nicht verhindert würde? Das geschieht über verzögerte Methylierung der GATC-Sequenz durch die dam-Methylase. So ist es möglich, zwischen Elternstrang und neu synthetisiertem Strang zu unterscheiden (Elternstrang ist ja sowieso methyliert um eigene DNA durch Restriktionsenzyme nicht zu beschädigen). Würde das nicht verhindert werden, könnte eine tetraploide Zelle (=Zelle mit veränderter DNA-Menge) entstehen.


2.

  • ab) Wie kann man zeigen, dass ein Protein an ein Stück DNS bindet? Beschreiben Sie zwei Methoden: Prinzip!  1)Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) und 2)DNAse Footprinting  siehe Antworten weiter unten
  • c) Wieso kann ein Protein sequenzspezifisch an eine doppelsträngige DNS binden, wo doch die Basen in Basenpaaren bereits in gegenseitigen Kontakten verwendet werden? In den major groove und den minor groove ragen die Atome und Atomgruppen, die an die aromatischen Ringe der Purin- (A + G) und Pyrimidinbasen (T + C) gebunden sind  z.B. -NH2, -O, -CH3). Ein Protein kann nun über seine Aminosäurereste (Seitengruppen) mit diesen Atomen in Wechselwirkung treten (z.B. Wasserstoffbrücken oder hydrophobe Wechselwirkungen bilden). Da AT und GC verschiedene Substituenten haben, können Proteine verschiedene Basenpaar-Sequenzen erkennen, ohne die DNA aufschmelzen zu müssen. Neben den wichtigsten Interaktionen (H-Brücken und hydrophobe WW) spielen aber auch vdW-Kräfte eine Rolle und bei bestimmten pH-Werten auch ionische WW).
  • d) Gibt es sequenzspezifische Endonukleasen? Geben Sie ein Beispiel! Ja es gibt sequenzspezifische Endonukleasen. Beispiele wären EcoRI, BamHI, AluI , HindIII, Sau3A

3. Analyse der Karte eines Gens und Vorhersage von Southern Blot-Ergebnissen

  • a) Wie groß ist die cDNA, wie groß ist die kodierende Sequenz? (bitte Rechnung aufschreiben) Die cDNA ist eine „DNA-Form“, die der mRNA entspricht und somit zwar die Exons (kodierende Teile und nicht kodierende Teile) enthält, nicht aber die Introns (diese wurden während der Transkription aus dem Primärtranskript herausgespleißt). Somit ergibt sich für die cDNA eine Länge von 0,2 + 2 + 0,4 + 3 + 0,3 + 2,5 = 8,4kb. Für die kodierende Sequenz ergibt sich eine Länge von 2 + 0,4 + 3 = 5,4kb.
  • b) Zeichnen Sie eine Restriktionskarte der vollständigen cDNA. Sie ist so kloniert, dass am Anfang und am Ende je eine HindIII Schnittstelle entstanden ist.
  • c) Sie machen einen Verdau von genomischer DNS mit EcoRI, trennen die Fragmente am Gel auf und hybridisieren mit der vollständigen cDNA. Was für Fragmente sehen Sie auf dem Southern Blot? (bitte die Rechnung aufschreiben und erklären) Auf dem Southern Blot sieht man nur diejenigen Restriktions-Fragmente, die Exons enthalten (und somit natürlich Sequenzen, mit denen die cDNA hybridisieren kann). Also: 5,3 kb (2,1 + 0,2 + 2 + 1), 3,2 kb (0,5 + 0,4 + 2,3), 5,5 kb (2,2 + 3 + 0,3) und 2,6 kb (2,5 + 0,1).
  • d) Ihr Southern Blot ist nicht schön, Sie sehen die Banden kaum im Schmier. Könnten Sie Ihre cDNA-Probe so modifizieren, dass Sie weniger Hybridisierung haben, die nicht vom analysierten Locus kommt? Wie und warum? Das liegt (vermutlich) an den repetitiven Sequenzen am Ende der cDNA liegt. Wenn es sich hier z.B. um Alu-Sequenzen handelt, kommen sie im Genom sehr oft vor (d.h. in einem Großteil der Fragmente, die aus dem genomischen Verdau resultieren). Daher kann die cDNA-Probe mit fast jedem Fragment (ein bisschen) hybridisieren und im Southern Blot ist nur Schmier auszumachen. Um weniger Hybridisierung zu bekommen müsste man die Alu-Sequenzen aus der cDNA entfernen. Hierzu würde man sich geeigneten Restriktionsenzymen (AluI, das Alu-Sequenzen in 2 Teile von 170bp und 130bp schneidet und einem anderen Enzym, das die Enden der repetitiven Sequenz schneidet) bedienen mit anschließender Ligation der restlichen cDNA.

4. Rekombination

  • a) Was sind die einzelnen molekularen Schritte in der homologen Rekombination? Als erstes macht eine Endonuklease einen Doppelstrangbruch in einem Chromosom (z.B. väterliches Chromosom). Dann erzeugt eine Exonuklease zwei überstehende 3’-Enden, welche die homologe Region eines zweiten Chromosoms (z.B. mütterliches Chromosom) finden. Es kommt nun zur Synapsis, wobei ein so genannter heteroduplex joint (=Bereich, in dem Stränge von verschiedenen DNA-Helices basenpaaren) entsteht. Durch Schneiden der Stränge kommt es zum Auflösen des Komplexes und zur Trennung der beiden Doppelstränge. Das crossing-over ist nun vollzogen, d.h. die beiden Stränge haben genetisches Material. ausgetauscht. Das Ganze geschieht in der Prophase der Meiose I.
  • b) Was ist die Rolle von RecA? Das RecA-Protein (das menschliche Pendant zum bakteriellen RecA-Protein ist das Rad51-Protein) katalysiert die DNA-Synapsis in der generellen Rekombination. Dazu windet es sich um einen DNA-Einzelstrang und bildet mit einer DNA-Doppelhelix einen so genannten Drei-Strang-Kopmplex, der aber instabil ist. Weil dieser Komplex jedoch in einem Bereich homologer Sequenzen entstanden ist, wird ein DNA-Heteroduplex geformt sowie ein DNA-Einzelstrang, welcher vom ursprünglichen Einzelstrang aus der Doppelhelix verdrängt wurde. Beide Moleküle werden anschließend entlassen, wobei es eben zur Rekombination gekommen ist. Kurz gesagt: RecA-Protein schmilzt dsDNA auf und hybridisiert einen der entstandenen Einzelstränge mit einem neuem Einzelstrang. Dafür wird Energie benötigt ( ATP-Hydrolyse). Außerdem in vitro beobachtet: Spontane branch migration ist back-and-forth, also ein random-Prozess – sodass es kaum zu Strangaustausch (=Rekombination) kommt. RecA-Protein-vermittelte branch migration hingegen schreitet sukzessive in einer Richtung fort und garantiert somit erfolgreiche Rekombination.
  • c) Was ist eine Holliday Junction und was passiert dort? Eine Holliday Junction ist ein (oftmaliges) Zwischenstadium bei der homologen Rekombination. Es ist eine einzigartige Struktur, bei der es zum reziproken (=gegenseitigen) Strangaustausch zwischen zwei DNA-Doppelhelices kommt, die miteinander gepaart haben. Man unterscheidet 3 Isomere: (a)die ursprünglich geformte Struktur mit 2 crossing-strands (Innenseite) und 2 non-crossing-strands (Außenseite); (b)die offene, symmetrische Struktur – die so genannte open form; und (c)die dritte Form, die durch weitere Isomerisierung entsteht und umgekehrt dasselbe wie die ursprünglich geformte Struktur ist.
  • d) Was ist Genkonversion? Unter Genkonversion versteht man den nicht-reziproken (=nicht-gegenseitigen) Austausch von DNA  ein Strang erhält netto eine Sequenz, der andere Strang verliert netto eben diese Sequenz. Dies kann z.B. während der Meiose passieren, wenn der heteroduplex joint gebildet wird und die homologen Sequenzen des mütterlichen und des väterlichen Chromosoms leicht voneinander abweichen (d.h. wenn in dieser Region ein paar Mismatches auftreten). Denn dann wird das mismatch-repair-System aktiv, das aber Nukleotide nur aus einem der beiden Stränge (väterlich ODER mütterlich) herausschneiden kann  die Folge davon ist Genkonversion.

1. Transkription und Replikation

  • a)Die durchschnittliche Lebensdauer von eukaryotischer mRNA ist wesentlich länger als von prokaryotischer: weshalb? Weil die Transkription bei Eukaryoten im Zellkern stattfindet (und nicht wie bei den Prokaryoten im Cytoplasma), muss die neu synthetisierte mRNA zuerst noch zu den Ribosomen (=Orte der Proteinbiosynthese) gebracht werden. Da dies natürlich Zeit benötigt, hat eukaryotische mRNA im Mittel eine höhere Lebensdauer als prokaryotische.
  • b) Was ist ein Promoter, was ist ein Enhancer?
  • c) Ist Transkription oder Replikation in E.coli schneller (gemessen in Nukleotide/sec)? Warum ist das notwendig? E. Coli hat ein zirkuläres Genom mit einem Ori, d.h. es wird nach dem Schema der bidirektionalen Replikation repliziert  es arbeiten nur 2 DNA-Polymerasen ( fork meets fork  Stopp, denn alles repliziert  meist keine Termination). Bei der Transkription hingegen arbeiten bei guten Lebensbedingungen ca. 2000-5000 RNA-Polymerasen gleichzeitig. Somit ist klar, dass die Replikation gemessen in Nukleotiden/sec viel, viel schneller ablaufen muss als die Transkription (Replikation 800bp/sec; Transkription 40 Nukleotide/sec).
  • d) Ist Transkription oder Replikation genauer –gemessen in Fehler/eingebaute Base? Warum ist das wichtig? Replikation ist viel, viel genauer, da es unheimlich wichtig ist, dass das Erbgut identisch weitergegeben wird, um schwere Krankheiten zu vermeiden (vergleiche: somatische Zellen  Zellen der Keimbahn). Bei der Transkription ist das nicht ganz so tragisch, denn falls bei einem Protein eine falsche Base und in der Folge eine falsche AS eingebaut wird, ist dies egal, da das funktionsuntüchtige Protein einfach abgebaut werden kann.

3. PCR

  • a) PCR ist eine gute Methode um festzustellen, ob eine bestimmte Sequenz, also ein STS in einer DNS vorhanden ist, z.B. in einem YAC Klon. STS-Gehalt-Analyse wurde verwendet um nach Überlappungen zwischen YAC Klonen zu suchen. Wie funktioniert das? Zeichnung! STS (sequence tagged site) ist eine im Genom einzigartige Sequenz; d.h. STS ist eine Einzelkopie und markiert daher einen bestimmten Platz im Genom  Orientierungspunkt z.B. für Überlappungen. Um beispielsweise zu überprüfen, ob ein DNA-Fragment STS enthält, macht man mit dem Fragment eine PCR und verwendet dabei einen spezifischen Primer, der komplementär zur STS ist. Wenn nun in einer PCR Fragmente der erwarteten Größe auftreten, so ist dies ein Beweis für die Anwesenheit der STS im untersuchten DNA-Fragment. Wenn man nun z.B. vier Fragmente genomischer DNA hat, von denen Fragment 1 STS1-STS5 enthält, Fragment 2 STS3-STS10, Fragment 3 STS4-STS10 und Fragment 4 STS10-STS13, so kann man diese Fragmente ordnen, indem man nach Überlappungen in den STS sucht. In dem gezeigten Beispiel würde Fragment 2 nicht gebraucht werden, da sich auch Fragment 3 mit Fragment 1 überlappt  wäre nur ein Mehraufwand an Sequenzierarbeit (Prinzip des minimal tiling path). Also man sieht, dass jeder größere Klon durch seinen „STS-Gehalt“ charakterisiert werden kann.
  • b) Wenn eine Mutation in der Sequenz aufgetreten ist, die amplifiziert wird, - also zwischen zwei Primern liegt – spielt das eine Rolle für die DNS-Bande, die man dann am Gel sieht? Nein, das spielt keine Rolle, da die DNA-Polymerase ja eine zur Vorlage komplementäre Sequenz synthetisiert und sich nicht von evtl. aufgetretenen Mutationen beeinflussen lässt.
  • cd) Wenn eine Mutation von einer oder sehr wenigen Basen in der Sequenz aufgetreten ist, die den Primern entspricht, so kann das zur Verringerung, zum vollständigen Verlust oder auch zu unveränderter Produktmenge führen: Wieso? (Tipp: Position) Wie kann man das eventuell steuern? Liegt die Mutation am 5’-Ende des Primers, so ist dies relativ egal, weil die DNA-Synthese am 3’-Ende beginnt und die DNA-Polymerase sich gut mit dem DNA-Einzelstrang verbindet. Liegt die Mutation jedoch am 3’-Ende, kann die DNA-Polymerase dort keinen guten Halt finden und die Synthese wird schlecht oder gar nicht begonnen. In diesem Fall muss man einfach den Primer um eine oder ein paar Basen am 3’-Ende kürzer machen, damit er wieder gut mit der zu amplifizierenden DNA hybridisieren kann.

4. mehr Transkription und Replikation

  • ab) Beim Phagen Lambda gibt es Rolling Circle Replication. Was bedeutet das? Was geschieht mit dem Produkt dieser Replikation? Das Lambda Genom besteht aus zirkulärer dsDNA (durch die cos-sites an den Enden konnte eine Zirkularisierung erfolgen). Bei der Rolling Circle Replication wird der Lambda DNA-Ring nun beim Origin mit einer passenden Endonuklease gespalten, dadurch entsteht ein 5’-Ende und ein 3’-OH-Ende. Letzteres dient der DNA-Polymerase III als Primer, d.h. an das 3’-OH-Ende werden neue Nukleotide angehängt. Somit wird der alte Strang sukzessive vom neuen verdrängt, wobei sich der Ring gewissermaßen „abrollt“ ( rolling circle) und der innere DNA-Strang dadurch ständig als Matrize für die DNA-Synthese zur Verfügung steht. Hat der Ring eine Runde gedreht, erreicht der verdrängte alte Strang die so genannte unit lenght. D.h. diese unit length kann entweder entlassen werden (und später zirkularisieren und doppelsträngig gemacht werden) oder der Ring bewegt sich einfach weiter, wobei dann so genannte multimere Stränge entstehen (das sind Stränge, die aus mehreren aneinander gereihten unit lengths bestehen und somit mehrere Kopien der selben DNA enthalten). Solche multimeren Stränge können dann enzymatisch gespalten werden, wodurch wiederum unit lengths entstehen, die zirkularisieren und doppelsträngig gemacht werden können. Schlussendlich wird die replizierte DNA in die Phagenköpfe eingebracht, sodass „kompetente“ Phagen entstehen.
  • c) Was sind die Eigenarten mitochondrialer DNS-Replikation? Mitochondrien (und auch Chloroplasten) haben ein einziges ringförmiges Genom wie das auch bei Bakterien zu finden ist (also keine linearen Chromosomen wie bei den Eukaryoten). Dieses wird nach dem asymmetrischen Prinzip (auch D-Loop genannt) repliziert. Dabei beginnt die Replikation am schwereren Strang ( viele Purin-Basen), d.h. der L Strang wird synthetisiert, und wenn die Replikation schon ein Stück weit fortgeschritten ist, dann verdrängt der neue L Strang den Elternstrang und der D-Loop wird größer. Erst wenn der verdrängte Elternstrang den origin des leichteren Stranges ( viele Pyrimidin-Basen) passiert, beginnt die Synthese des H Stranges. Die neu synthetisierten Stränge dissoziieren ab, sobald ihre Synthese komplettiert ist. Man kann also sagen, dass bei der mitochondrialen D-Loop Replikation – im Gegensatz zur „herkömmlichen“ Replikation – beide Stränge kontinuierlich als leading strands synthetisiert werden, wenngleich zeitlich versetzt.
  • d) Wie wird das Genom von Retroviren vermehrt? Bei Retroviren liegt die Erbinformation als RNA vor. Zuerst adsorbiert der Virus an die Zelle, d.h. die Virushülle bindet an ihren zellulären Rezeptor. Dann Verschmelzung der Virushülle mit der Zellmembran  Einbringung der RNA in die Zelle (=Infektion). Jetzt muss die einzelsträngige RNA in doppelsträngige DNA umgeschrieben werden. Dies geschieht mittels des vom Virus mitgebrachten Enzyms Reverse Transkriptase. Mit Hilfe eines weiteren mitgebrachten Enzyms – der Integrase – schafft es der Virus, seine neu synthetisierte DNA ins Wirtsgenom zu integrieren ( Provirus). Die Vermehrung der integrierten Virus-Gene passiert nun während der Zellteilung mit der Verdopplung der Wirts-DNA. Doch auch Retrotranspositions-Vermehrung möglich.

1.

  • a) Was ist Telomerase? Wie funktioniert sie? Telomerase ist ein Enzym, das aus einem Protein und einem lange RNA-Anteil besteht. Es ist eine reverse Transkriptase, die den RNA-Anteil als Matrize benutzt. Es stellt die Endstücke der Chromosomen (Telomere) wieder her. Dadurch wird verhindert, dass sich die Telomere mit jeder Zellteilung verkürzen, was schließlich zum Zelltod führen würde. Funktiosweise: Der RNA-Anteil der Telomerase lagert sich an die komplementäre Sequenz am 3’-Ende der chromosomalen DNA an, bildet ein überhängendes 5’-Ende und dient somit als Matrize für die Verlängerung des 3’-Endes der chromosomalen DNA. Dann werden die Nukleotide ans 3’-Ende ansynthetisiert und wenn keine Matrize mehr zur Verfügung steht (wenn also das 5’-Ende des Telomerasen-RNA erreicht ist), dann stoppt die DNA-Synthese, es kommt zu Translokation des RNA-templates der Telomerase um wenige Nukleotide (~6) und es kann am 3’-Ende der chromosomalen DNA neuerlich zu DNA-Synthese und Verlängerung kommen.
  • b) Wozu braucht die Zelle Telomerase, was passiert wenn sie nicht vorhanden ist? Die Zelle (d.h. genauso genommen nur Zellen der Keimbahn) braucht Telomerase, um die Enden linearer Chromosomen (Telomere) nach der Zellteilung zu verlängern. Wäre dieses Enzym nicht vorhanden, würde das Chromosom sich sukzessive mit jeder Zellteilung verkürzen, bis eine Minimalgröße erreicht ist und die Zelle sich nicht mehr weiter teilen kann. Dies würde schlussendlich zum Zelltod führen.
  • c) Gibt es Telomerase in E.coli? Warum? Nein, Telomerase wird nur an den Telomeren (= lineare Chromosomenenden) in Keimbahnzellen bei Eukaryoten gefunden. Bei E. Coli liegt der Grund auf der Hand  das E. Coli Genom liegt ringförmig vor, besitzt also keine linearen Enden, die sich bei der Zellteilung verkürzen könnten.
  • d) Warum dürfen in der Zelle keine freien Doppelstrang-Enden vorliegen? Freie Doppelstrang-Enden würden in der Zelle sofort als „damage“ bzw. als „break“ erkannt werden und sind daher nicht stabil. D.h. es würden sofort Reparatursysteme aktiv werden und es würde zu end-joining, Mutation und Rekombinationsereignissen kommen.

1. Protein-DNS Interaktionen

  • a) Geben Sie Beispiele für sequenz-spezifische und sequenz-unspezifische DNS-bindende Proteine. Sequenz-spezifische DNA-bindende Proteine sind vor allem Regulatorproteine (so genannte Transkriptionsfaktoren - z.B. Aktivatorproteine, die den Enhancer binden oder TATA-box binding protein), Polymerasen (DNA-Polymerase bindet spezifisch an den Ori; RNA-Polymerase bindet spezifisch an Promotor). Auch ORC ist ein solches Protein – es bindet spezifisch an den Ori. Sequenz-unspezifische DNA-bindende Proteine sind vor allem die Histone (verpacken die DNA in so genannten Nukleosomen) und die SSBP (single strand binding proteins – verhindern spontane Reassoziation zwischen zwei Strängen). DNA-bindende Proteine im Allgemeinen bestehen aus Zinkfinger-Motiven, Leucin-Zipper und Helix-turn-Helix. Es lässt sich darüber streiten, ob DNAsen (unspezifisch) und Restriktionsenzyme (spezifisch) auch DNA-bindende Proteine sind oder nicht.
  • b) Man kann in vitro mit dem Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) die Fähigkeit eines Proteins, an eine bestimmte kurze DNS-Sequenz zu binden ( z.B. TF), bestimmen. Wie funktioniert das? Also man inkubiert Proteine mit einer (bekannten) DNA-Sequenz und trägt dies auf ein Gel auf. Durch Anlegung eines elektrischen Feldes beginnt der Protein-DNA-Komplex aufgrund seiner Größe und Ladung durch das wie ein Molekularsieb wirkende Gel zu wandern. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist dabei spezifisch für diesen Komplex. Durch Auflegen eines Röntgenfilms kann die (radioaktiv markierte) DNA detektiert werden. Weit gewanderte DNA deutet auf ungebundene DNA hin, stärker retardierte DNA deutet auf Proteinbindung hin.
  • cd) DNS Footprinting macht die Bindungsstelle eines Proteins an DNS sichtbar. Beschreiben sie so ein Experiment! Man benutzt DNAse um die DNA zu schneiden. Dabei entstehen Fragmente unterschiedlichster Länge und es ergibt sich in der Gelelektrophorese eine nahezu kontinuierliche Verteilung (da die Wanderungsgeschwindigkeit von der Länge der Fragmente abhängt). Nur dort, wo ein Protein die DNA bedeckte, konnte die DNAse nicht wirken, was sich in der Gelelektrophorese durch eine Lücke bemerkbar macht (der schwere Komplex aus DNA und Protein wandert sehr langsam). Solch eine Lücke wird als Fußabdruck eines Proteins bezeichnet – daher der Name DNAse Footprinting.

2. DNS-Sequenzierung

  • a) Was ist das Prinzip der Sanger Sequenzierung? Die Didesoxymethode nach Sanger wird auch Kettenabbruch-Synthese genannt und stellt eine enzymatische Methode dar. Ausgegangen wird von einem Primer bekannter Sequenz, der sich an den zu sequenzierenden DNA-Einzelstrang anlagert. Dieser Einzelstrang ist gleichzeitig die Matrize für die DNA-Synthese durch die DNA-Polymerase. In vier sonst gleichen Ansätzen (alle beinhalten die vier Nukleotide) wird je ein Nukleotid als ddNTP hinzugegeben (werden ddNTPs hinzugegeben, stoppt die Synthese, da keine 3’-OH-Gruppe für die Verknüpfung mit der nächsten Phosphatgruppe zur Verfügung steht). Somit entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die jedoch in jedem Ansatz stets mit demselben ddNTP enden. Nach der Sequenzier-Reaktion werden die fluoreszenzmarkierten Kettenabbruch-Produkte (entweder der Primer oder das ddNTP ist markiert) aus jedem Ansatz im Gel der Länge nach aufgetrennt. Durch Vergleich der vier Ansätze kann die Sequenz abgelesen werden (die abgelesene Sequenz entspricht dabei dem coding-strand, welcher natürlich komplementär zum template-strand ist).
  • b) Welche Komponenten müssen in einer Sequenzierreaktion vorhanden sein? In einer Sequenzierreaktion müssen vorhanden sein: Puffer, DNA-template, dNTPs, ddNTPs, DNA-Polymerase, Primer (die Primer-Sequenz muss in der zu sequenzierenden DNA einmal enthalten sein – das ist für den Beginn der DNA-Synthese notwendig und garantiert außerdem, dass alle neu synthetisierten DNA-Moleküle an der selben Stelle beginnen).
  • c) Was passiert wenn man
  1. zuviel oder
  2. zu wenig Didesoxynukleotidtriphosphat zugibt?
    1. Wenn man zuviel ddNTPs zugibt, kommt es zu keiner Sequenzierreaktion, da die DNA-Polymerase nicht mehr wirken kann.
    2. Wenn man zuwenig ddNTPs hinzugibt, kommt es zwar zu einer Sequenzierreaktion, jedoch ist das Ergebnis nutzlos, da zu wenige DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge entstanden sind und somit keine Sequenz abgelesen werden kann.
  • d) Die Sequenzierung erfolgt in einer linearen PCR Reaktion - d.h. in vielen Schritten - bei denen nach jeder DNS-Synthese denaturiert werden muss. Wie sieht der zeitliche und der Temperatur-Ablauf der Reaktion aus und wie viel Produkt kann dabei maximal entstehen? Bei einer linearen PCR-Reaktion entsteht DNA nicht auf eine exponentielle Weise, sondern auf eine lineare; d.h. die DNA-Menge nach n Zyklen = DNA-Menge zu Beginn * n (oder anders ausgedrückt: n Zyklen ergibt n Einzelstränge).

3. Rekombination und Integration

  • a) Was für Arten von Transposons gibt es? Ein Transposon oder springendes Gen ist ein DNA-Abschnitt bestimmter Länge auf einem Chromosom. Es umfasst ein oder mehrere Gene und hat die Möglichkeit, seinen Ort im Genom zu verändern (Transposition). Prinzipiell gibt es drei verschiedene Arten von Transposons: DNA-only-Transposons (=Klasse II Transposons; kodieren für Transposase und bewegen sich als DNA), Retroviral-like Retrotransposons (Klasse I Transposons; kodieren für Reverse Transkriptase und bewegen sich via RNA – sind einem Retrovirus sehr ähnlich) und Nonretroviral Retrotransposons (Klasse I Transposons; kodieren ebenfalls für Reverse Transkriptase und bewegen sich via RNA – sind einem Retrovirus nicht ähnlich).
  • b) Wie können sich Transposons innerhalb des Genoms bewegen? Klasse II Transposons bewegen sich innerhalb eines Genoms, indem sie entweder aus der DNA herausgeschnitten und an anderer Stelle wieder eingesetzt werden (konservative Transposition; „cut & paste“) oder indem sie kopiert ( DNA-Polymerase) und an anderer Stelle wieder eingebaut werden (replikative Transposition; „copy & paste“). Klasse I Transposons hingegen bewegen sich innerhalb eines Genoms, indem sie transkribiert und die mRNA translatiert wird. Mit Hilfe der so erzeugten Proteine wird die mRNA in cDNA umgeschrieben (reverse Transkriptase) und wieder (an anderer Stelle) integriert.
  • c) Was ist site-specific recombination in Lambda? Lambda-Phagen können ihr Genom in das E. Coli Genom einfügen. Dies geschieht mittels reziproker Rekombination zwischen attP und attB  d.h. Lambda integriert sein Genom an bestimmten Stellen = site specific recombination. Dabei wird für die Integration ins Bakteriengenom das Phagengen int sowie das Hostgen IHF benötigt. Bei der Excision wird neben int und IHF zusätzlich noch xis benötigt.
  • d) Was ist homologous und non-homologous end joining? End Joining ist eine Möglichkeit der Reparatur von Doppelstrangbrüchen. Beim Nicht-Homologen End Joining (meistens von Säugern angewendet) wird der Bruch zwar behoben, jedoch geht dies einher mit Mutationen  „direkte Ligation“ der beiden Strangfragmente ohne die Anwesenheit eines homologen templates  d.h. es gehen Nukleotide verloren (Deletion) und es kommt somit zur Veränderung der DNA-Sequenz (jedoch auch Insertionen möglich). Das System des Homologen End Joining (meistens von Bakterien, Hefe und Drosophila verwendet) ist um einiges komplexer, dabei wird allerdings die komplette Sequenz ohne Mutation erhalten. Dazu bedient sich dieses System der Maschinerie der Rekombination, d.h. durch homologe Rekombination wird die Sequenz von einem zweiten Chromosom „kopiert“ und die Lücke zwischen den beiden Strangfragmenten wieder aufgefüllt  ein homologer Strang dient als Matrize.

4. Klonierung und Hybridisierung Sie haben ein Plasmid mit einem vollständigen humanen cDNA insert (d.h. die ganze mRNA ist in dem Klon repräsentiert), und einen cosmid Klon mit dem entsprechenden menschlichen Gen. Außerdem haben Sie einen cDNA Klon mit dem homologen Gen aus Schimpansen, einen mit dem homologen Gen aus Mäusen, einen mit dem homologen Gen aus Hefe. Sie schneiden alle Klone mit dem Restriktionsenzym EcoRI und lassen die Proben auf einem Gel laufen.

  • a) Was ist ein cosmid Klon und warum ist das Gen im cosmid kloniert worden? Ein Cosmid ist ein ringförmiges DNA-Molekül mit replication origin, cloning site, selektierbarem Marker und sog. cos-sites (cohesive sites). Diese cos-sites stammen vom Phagen Lambda und ermöglichen diesem eine Zirkularisierung des Genoms (die cos-sites sind identische Sequenzen, weisen aber aufeinander zu  inverted repeat). Somit kann der Phage seine DNA in den Köpfen verpacken. D.h. in der Folge, dass auch cosmide in Phagenköpfe verpackt werden können und über Vireninfektion effizient in E. Coli Zellen eingebracht werden können.

Das Gen ist also deshalb in einem cosmid kloniert worden, um über den Phagen Lambda möglichst einfach und effizient in die Bakterienzelle eingeschleust werden zu können. Weiterer Grund: die lambda insert Größe (max. 23kb) war wahrscheinlich zu klein (cosmide hingegen habe eine maximale Insertgröße von 40kb).

  • b) Erwarten Sie, dass die cDNA Fragmente in den verschiedenen Klonen identische Größen haben? Sind welche wahrscheinlich identisch mit den genomischen? Warum? Die cDNA-Fragmente sind vermutlich in etwa gleich groß. Identisch mit den genomischen Sequenzen ist am ehesten die Hefe-cDNA, weil Hefegene nur selten Introns haben, die bei der Transkription herausgespleißt werden.
  • c) Sie blotten Ihr Gel und hybridisieren mit dem insert des menschlichen cDNA Klons. Bei der Hybridisierung verwenden Sie eine Temperatur, die nahe am Schmelzpunkt eines perfekten Hybrids liegt. Erwarten Sie, dass alle Banden hybridisieren? Warum? Es hybridisieren nur jene Banden, die die wenigsten Mismatches haben, also Mensch und Schimpanse. Sie können gewissermaßen am stärksten an das humane cDNA insert binden, weil die meisten H-Brücken ausgebildet werden können und das Hybrid somit auch bei hoher Temperatur noch stabil ist.

d) Sie machen dieselbe Hybridisierung bei niedriger Temperatur. Bekommen Sie mehr oder weniger Banden? Warum? Man erhält mehr Banden, weil das humane cDNA insert nun auch mit DNA von weiter verwandten Spezies (mehr Mismatches) hybridisieren kann.

1.

  • a) Was ist Denaturierung von DNS? Was ist Hybridisierung? Was passiert dabei? Als Denaturierung von DNA wird der Vorgang bezeichnet, bei dem der DNA-Doppelstrang aufgeschmolzen wird. Dies kann mittels Hitze oder mittels Zugabe von Alkali geschehen. Prinzipiell ist zu sagen, dass dabei die H-Brücken zwischen den komplementären Basen aufgebrochen werden. Hybridisierung bezeichnet dagegen den genau gegenteiligen Vorgang: Unter geeigneten Bedingungen können zwei getrennte Einzelstränge ganz oder teilweise reassoziieren, d.h. komplementäre Basen aus den beiden Strängen finden einander und bilden H-Brücken aus (Hybridisierung). Hybridisierung klappt umso besser, je komplementärer die beiden Einzelstränge sind, d.h. je weniger mismatches sie haben.
  • b) Wovon hängt die Geschwindigkeit der Hybridisierung ab? Die Geschwindigkeit der Hybridisierung hängt im Wesentlichen von drei Faktoren ab: Von der Konzentration der Reaktanden (gemeint ist die Konzentration komplementärer Sequenzen, nicht der gesamten DNA), von der Temperatur (bei erhöhter T ist die Zahl der Zusammenstöße größer) und von der Größe der DNA-Fragmente (lange Fragmente bewegen sich langsamer).
  • c) Wovon hängt der Schmelzpunkt des Hybrids ab? Der Schmelzpunkt eines Hybrids (=Doppelstrang) hängt ab vom 1)Lösungsmittel ( Salzkonzentration; schirmt die Ladungen ab), vom 2)ph-Wert ( bestimmt die Ladungen und somit die Stabilität der H-Brücken), vom 3)GC-Gehalt ( GC ist stabiler als AT) und von der 4)Zahl der Mismatches (Mismatches machen das Hybrid unstabiler)
  • d) Sie haben einen Southern Blot von Hühner DNS gemacht und wollen cDNA von einem menschlichen Gen als Sonde zur Hybridisierung verwenden. Wie stellen Sie sicher, dass die Sequenzen, die zwar verwandt aber nicht identisch sind, hybridisieren? Man muss solche Reaktionsbedingungen wählen, bei denen auch DNAs mit einer größeren Anzahl von Mismatches noch miteinander hybridisieren. Konkret heißt das 1)hohe Konzentrationen und 2)niedrige Temperatur.

2. Eukaryotische Promotoren

  • a) Was ist ein Promoter, was ein Enhancer? Was für Elemente enthält er? Ein Promoter ist eine DNA-Sequenz, die es ermöglicht, dass ein Gen transkribiert wird (die RNA-Polymerase bindet sequenz-spezifisch an den Promoter). Elemente: +1-Element (TSS – transcription start site); TATA-box; URS (Repressor) – bei Eukaryoten; UAS (Enhancer) – bei Eukaryoten. Siehe auch „Prüfungsfragen 2“! Ein Enhancer ist eine kurze DNA-Region, die essentiell für die Transkriptionskontrolle ist und weiter upstream vom TSS liegt. D.h. ein Enhancer enthält Bindungsstellen für diverse Proteine (Transkriptionsfaktoren), die –wenn sie gebunden sind – die Transkription forcieren  sie beeinflussen die Anlagerung des Transkriptionskomplexes an den Promoter und verstärken somit die Transkriptionsaktivität eines Gens

b) Wie kann ein sequenzspezifischer Transkriptionsfaktor seine Bindungsstelle erkennen? In den major groove und den minor groove ragen die Atome und Atomgruppen, die an die aromatischen Ringe der Purin- (A + G) und Pyrimidinbasen (T + C) gebunden sind  z.B. -NH2, -O, -CH3). Ein Protein (z.B ein sequenzspezifischer Transkriptionsfaktor) kann nun über seine Aminosäurereste (Seitengruppen) mit diesen Atomen in Wechselwirkung treten (z.B. Wasserstoffbrücken oder hydrophobe Wechselwirkungen bilden). Da AT und GC verschiedene Substituenten haben, können Proteine verschiedene Basenpaar-Sequenzen erkennen, ohne die DNA aufschmelzen zu müssen. Neben den wichtigsten Interaktionen (H-Brücken und hydrophobe WW) spielen aber auch vdW-Kräfte eine Rolle und bei bestimmten pH-Werten auch ionische WW).

  • cd) Wie kann man in vitro experimentell nachweisen, dass ein Faktor an eine bestimmte DNS-Sequenz spezifisch binden kann?  Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) bzw. prinzipiell auch DNAse Footprinting (wenn man das Protein wieder runter wäscht und das DNA-Fragment anschließend sequenziert).

3. DNS Replikation

  • ab) Meselson und Stahl zeigten in ihrem Experiment, dass DNS semikonservativ repliziert wird, d.h. dass jeweils ein neu synthetisierter Strang mit einem alten in einer Doppelhelix zusammenkommen. Sie zeigten das durch Dichtegradienten. Phagen wurden in 15N wachsen gelassen (höhere Dichte als 14N), zu Zeitpunkt 0 wurde leichter Stickstoff zugegeben und die resultierende DNS zum Zeitpunkt 0 bzw. nach einer Replikationsrunde und nach 2 Replikationsrunden auf Dichtegradienten aufgetrennt. Zum Zeitpunkt 0 war eine Bande mit der Dichte von vollständig „schwerer“ DNS zu sehen. Wie sah das Resultat nach einer bzw. 2 Runden aus? Nach einer Runde lag Hybrid-Dichte-DNA vor (im Dichtegradienten Dichtemaximum bei 1,72 – jeweils aus einem alten schweren und einem neuen leichten Strang zusammengesetzt); nach zwei Runden ergaben sich Dichtemaxima bei 1,72 (diejenigen DNA-Moleküle, deren neuer Einzelstrang an einem schweren Strang synthetisiert wurde) und bei 1,71 (diejenigen DNA-Moleküle, deren neuer Einzelstrang an einem leichten Strang synthetisiert wurde). Zusammenfassung: nach einer Runde nur mittelschwere DNA; nach zwei Runden mittelschwere und leichte DNA.
  • c) Warum wird bei der Replikation der zweite Strang in Form von Okazaki Fragmenten polymerisiert? Aufgrund der Enzymeigenschaften der DNA-Polymerase (kann nur von 5’ nach 3’ synthetisieren) und dem antiparallelen Verlauf der beiden Elternstränge ergibt sich, dass nur einer der beiden Stränge kontinuierlich synthetisiert werden kann (leading strand). Der andere Strang (lagging strand) muss also diskontinuierlich, in Form von Okazaki-Fragmenten, synthetisiert werden.
  • d) Was für enzymatische Aktivitäten werden in der Replikation gebraucht (z.B. DNA Polymerase – Anhängen eines Desoxynukleosidtriphosphates an 3’ Ende des wachsenden DNA Strangs unter Abspaltung von 2 Phosphatresten – muss nicht alles so ausführlich sein) 1)DNA-Polymerase (Anhängen eines dNTP an das 3’-Ende des wachsenden Stranges), 2)Primase (stellt den für die DNA-Polymerase notwendigen Primer her), 3)clamp loader (hält die DNA-Polymerase auf der DNA), 4)Helicase (entwindet die Doppelhelix, indem sie die Basenpaarungen aufbricht  benötigt ATP, bewegt sich vor der DNA-Polymerase), 5)Topoisomerase (wirkt der Spannkraft, die durch das Entwinden der Doppelhelix entsteht, entgegen  stellt den Normalzustand der DNA wieder her), 6)ss binding proteins (halten die beiden Einzelstränge auseinander und verhindern somit erneute Basenpaarung), 7)Ligase (verbindet die stückweise und diskontinuierlich synthetisierten Okazaki-Fragmente am lagging strand)

4.

  • a) Was ist eine Genbibliothek, wofür kann man sie verwenden? Welche Eigenschaften soll sie haben? Eine Genbibliothek beherbergt das gesamte Genom eines Organismus in Form von definierten DNA-Teilstücken auf Vektoren in einzelligen Trägerorganismen (z.B. E. Coli, Hefe) oder Phagen. Beim Anlegen einer Genbibliothek wird zuerst die genomische DNA enzymatisch verdaut (z.B. mit Restriktionsenzymen), sodass zunächst Fragmente des kompletten Genoms eines spezifischen Organismus hergestellt werden. Jedes Fragment enthält ein oder mehrere Gene und wird separat über einen so genannten Vektor in einen Trägerorganismus eingebracht. Der Trägerorganismus vervielfältigt einhergehend mit seiner eigenen Vermehrung das ihm eingefügte DNA-Fragment und bildet auf entsprechendem Nährboden Kolonien. Im Labor werden entsprechend viele Kolonien erzeugt, wie benötigt werden um das gesamte Genom eines Organismus – fragmentiert in Einzelkolonien – unterzubringen und somit zu repräsentieren. Eine Genbibliothek dient also zur Speicherung bzw. zur Vermehrung von DNA-Fragmenten (somit ist es natürlich möglich, ein gewünschtes DNA-Teilstück zu vermehren und anschließend zu isolieren). Eigenschaften sollte eine Genbibliothek folgende haben: 1)der Trägerorganismus sollte in allerlei Hinsicht einfach zu handhaben sein, 2)die DNA-Inserts sollten möglichst stabil sein, 3)die Klone (bzw. die Insertgrößen der Vektoren) sollten groß sein, um ein Genom in wenigen Klonen darstellen zu können, 4)die Klone sollten überlappen, sodass man sie ordnen kann ( STS-Kartierung).
  • b) Was braucht man, um eine Genbibliothek zu erstellen? Um eine Genbibliothek zu erstellen braucht es 1)einen einzelligen Trägerorganismus (z.B. E. Coli oder S. cerevisiae), 2)geeignete Vektoren mit stabilen inserts, 3)von der Größe her passende DNA-Fragmente, die in die Vektoren eingebracht werden können, 4)eine Methode zum Ordnen der Klone (z.B. STS-Kartierung).
  • c) Lambda Vektoren waren lange Zeit das Hauptwekzeug zur Herstellung genomischer Bibliotheken. Was haben cosmid Vektoren mit Lambda gemeinsam, was mit Plasmiden? Mit Lambda: cos-sites (cohesive sites zum Zirkularisieren der DNA und zum Verpacken in die Phagenköpfe); mit Plasmiden: origin of replication, (multiple) cloning site, selektierbarer Marker
  • d) Was für Elemente sind in YAC Vektoren vorhanden, die für die Verwendung als Klonierungsvektor wichtig sind? (z.B. origin of replication) YAC Vektoren enthalten einen Hefe-origin of replication (=ARS – autonomous replicating sequence), weitere Attribute eines Chromosoms (Telomere, Centromer-Sequenzen), multiple cloning sites (EcoRI, BamHI), selektierbarer Marker (z.B. Ampicillin-Resistenz),

Der Phage Lambda

  • a)Wenn ein Lambda Phage eine Zelle infiziert, so kann er lytisch wachsen oder als Lysogen weiter bestehen. Wie unterscheiden sich diese Zustände? Sind sie stabil? Oder kann der Phage hin und her wechseln? Warum? Unterschied lytischer Zyklus/lysogener Zyklus: Im lytischen Zyklus benutzt der Phage die Wirtsmaschinerie zum Vervielfältigen seines Erbguts sowie zum Herstellen der benötigten Proteine (Phagenpartikel). D.h. es werden in der Zelle viele kompetente Phagen erzeugt (ca. 100/Zelle), die schlussendlich die Zelle lysieren (=das Bakterium stirbt ab) und umliegende Zellen infizieren. Im lysogenen Zyklus hingegen integriert der Phage sein Genom in das E. Coli-Wirtsgenom (dabei wird für die Integration ins Bakteriengenom das Phagengen int sowie das Hostgen IHF benötigt), was der Zelle Immunität gegen weitere Infektion verleiht. Das Phagengenom wird dabei mit jeder Replikation des Wirtsgenoms mitrepliziert. Es kommt zu keiner Lyse der Bakterienzelle. Frischauf: Die Entscheidung Lyse/Lysogenie muss möglich, aber in beiden Fällen irreversibel sein. Das ist durch den regulatorischen Mechanismus sichergestellt  die beiden Zustände sind also stabil (trotzdem kann durch Induktion ein Übergang vom lysogenen in den lytischen Zyklus erfolgen).
  • b)Wie erfolgt die Transkriptionskontrolle im lytischen Zyklus ?(von den Strategien her, nicht im Detail) Im lytischen Zyklus erfolgt die Transkriptionskontrolle durch das Gen cro sowie durch den Antiterminator Q. Strategie: cro verhindert die Synthese des Repressors, der für die Lysogenie notwendig ist; der Antiterminator Q bindet an die RNA-Polymerase und kontrolliert die Interaktion (Q ist notwendig für die Expression der late genes).
  • c)Was ist die Funktion von lambda Repressor und wie wird sie kontrolliert ?(auf das Prinzip kontrolliert) Der lambda Repressor hat die Aufgabe, Transkriptionseinheiten abzudrehen und die Transkription somit negativ zu beeinflussen. Dazu muss er an den Operator (Promotor) binden, sodass die RNA-Polymerase nicht mehr wirken kann. Der Repressor selbst (bzw. seine Synthese und Funktion) wird durch die Expression der Gene cro (verhindert seine Synthese) sowie cII und cIII (notwendig für seine Synthese) kontrolliert.
  • d)Lambda DNA kann nur aus linearen multimeren Genomen verpackt werden. Wie kommen diese Multimeren zustande? Da der Lambda-Phage nach dem rolling-circle Prinzip repliziert, kann nur unit-length DNA entstehen, die allerdings linear aneinander gereiht werden kann  auf diese Weise entstehen diese Multimeren.


Replikation

  • c)Was ist ein Origin of Replication und wie kann man herausfinden, welche Basen für die Funktion wichtig sind (im bakteriellen System)? Ein Origin of Replication ist ein kurzer DNA-Abschnitt, von dem aus die DNA-Synthese bei der Replikation beginnt. Es kann von dort aus entweder in nur einer Richtung repliziert werden oder auch in beide Richtungen (bidirektionale Replikation). Um herauszufinden, welche Basen für die Funktion wichtig sind, kann man gezielt Basen mutieren oder auch deletieren und schauen, ob die Funktion immer noch gegeben ist oder nicht.

d)Gibt es einen Zusammenhang zwischen Zellteilung und DNA-Replikation? Wie ist das organisiert (in höheren Zellen)? Kurze Erklärung. Sowohl Zellteilung (=Mitosephase) als auch DNA-Replikation (=Synthesephase; bildet zusammen mit G1 und G2 die Interphase) sind Teil des Zellzyklus: Während G1, S + G2 wächst die Zelle kontinuierlich, bevor sie sich dann in der M-Phase teilt (und die Erbinformation auf beide Tochterzellen übertragen wird). Kontrolliert wird das ganze über Cdks – cyclin-abhängigen Kinasen, die ihrerseits zur Klasse der Proteinkinasen gehören. Cdks aktivieren eine Vielzahl von anderen Enzymen zu bestimmten Zeitpunkten (z.B. S-Cdk während Synthesephase, M-Cdk während Mitosephase) durch Phosphorylierung. Wikipedia: Cdks bilden Komplexe mit den Cyclinen, die zellzyklusabhängige Konzentrationsänderungen durchlaufen. Die Cdks sind nur in Verbindung mit ihrem zugehörigen Cyclin aktiv. Dadurch kann die Aktivität der Cdks in der Zelle zeitlich gesteuert und reguliert werden. So wird ermöglicht, dass sie ihre Funktion in bestimmten Phasen des Zellzyklus ausführen, die an die zyklischen Konzentrationsänderungen der Cycline gekoppelt sind.


Hybridisierung

  • b)Sie haben eine Mischung aus E. Coli DNA und menschlicher DNA in kleine Stücke geschnitten, wie man das normalerweise für eine Hybridisierungsreaktion tut. Sie erhitzen die Lösung zum Denaturieren und lassen sie dann unter Standard-Bedingungen (Salz, Temperatur) renaturieren. Nach kurzer Zeit brechen sie die Renaturierungsreaktion ab. Es hat nur ein kleiner Teil hybridisiert. Was für Sequenzen erwarten sie in der doppelsträngigen DNA? Warum? Bei Hyridisierungsreaktionen ist es immer so, dass zuerst die hochrepetitiven DNA-Sequenzen miteinander basenpaaren. Somit werden auch hier (fast) ausschließlich repetitive Sequenzen in der doppelsträngigen DNA zu finden sein. Grund: (Hoch-) repetitive DNA liegt im Genom (und hpts. am Centromer) in sehr großer Kopienzahl vor (100.000fach bis teilweise 1 000.000-fach). Somit ist die Konzentration dieser Sequenz sehr hoch, was die „Partnerfindung“ bei einer Hybridisierungsreaktion beschleunigt.
  • c)Sie haben kleine Stücke menschlicher Einzelkopie-DNA in einer Hybridisierungslösung und stellen sie nach dem Denaturieren durch Erhitzen 24 Stunden auf Eis. Was passiert in der Zeit? Warum? Einzelkopie-DNA ist dadurch charakterisiert, dass sie in einem Genom quasi einzigartig ist. D.h. es gibt in solch einer Sequenz keine repetitiven Abschnitte  die Sequenzen haben mit anderen Sequenzen nur noch statistische Ähnlichkeit (da es ja nur 4 Basen gibt). Deshalb wird in diesen 24 Stunden keine Reassoziation erfolgen – zumal die Molekularbewegung durch das Eis sehr eingeschränkt und die Moleküle daher (fast) immobil sind  es werden nach 24 Stunden also immer noch Einzelstränge vorliegen.
  • d)Wenn man einen Southern Blot mit menschlicher genomischer DNA mit einem radioaktiv markierten menschlichen genomischen Klon hybridisiert, so gibt man eine große Menge unmarkierter menschlicher repetitiver DNA in die Hybridisierungslösung. Warum ist das notwendig, um einen Schmier zu vermeiden? In menschlicher genomischer DNA kommen viele repetitive Sequenzen vor, die übers ganze Genom verteilt sind (z.B. Alu). Wenn nun solche repetitiven Sequenzen auch in der Hybridisierungslösung vorliegen, so werden diese sich als erstes an die menschliche genomische DNA auf dem Southern Blot anlagern und mit dieser hybridisieren. D.h. der markierte, menschlich-genomische Klon hat einen Konkurrenten, der ihm Bindestellen wegschnappt ( der Klon kann nicht mehr in allen Regionen hybridisieren). Da dieser „Konkurrent“ des Weiteren nicht markiert ist, entstehen weniger Banden und Schmier wurde vermieden.


Reparatur

  • a)Was ist Mismatch repair? Welche Mutationen werden dadurch vermieden? Bei der DNA-Synthese werden hin und wieder falsche Nukleotide eingebaut. Dabei werden nicht alle durch die 3’5’ Exonuklease Aktivität der Polymerase entfernt  das Mismatch repair System ist die nächste Kontrolle – mismatches werden erkannt und entfernt. Dabei ist es wichtig, dass das neu eingebaute, falsche Nukleotid entfernt wird und nicht das korrekte auf dem alten Strang (wird bei E. Coli durch „lag of methylation“ der GATC-Sequenz sicher gestellt; bei Eukaryoten wird der neu synthetisierte Strang damit erkannt, dass noch Einzelstrangbrüche enthalten sind). Funktionsweise: 1)Eukaryoten: Die mismatch Proteine MutS und MutL sind beteiligt. MutS bindet spezifisch an ein mismatch (wahrscheinlich probiert MutS aus, welche Stellen der DNA leichter geknickt werden können ( bei einem Mismatch gibt es keine stabilisierenden H-Brücken)) und MutL scannt die Umgebung nach einem Einzelstrangbruch  Abbau des ganzen Einzelstranges zwischen MutS und MutL  dann Reparatur durch neuerliche DNA-Synthese. 2)Prokaryoten: Gleicher Mechanismus, nur dass anstatt MutL das Protein MutH aktiv wird, welches nun seinerseits (keine Einzelstrangbrüche, sondern) unmethyliertes GATC erkennt.
  • b)Was ist base excision repair? Welche Arten von Mutationen werden damit repariert? Base excision repair ist ein Reparatursystem zur Behebung von einzelnen Mismatches, die z.B. durch Deamination einer Base entstanden sind. This pathway starts with a DNA glycosylase. Here the enzyme uracil DNA glycosylase removes an accidentally deaminated cytosine in DNA. After the action of this glycosylase the sugar phosphate with the missing base is cut out by the sequential action of AP endonuclease and a phosphodiesterase. (These same enzymes begin the repair of depurinated sites directly.) The gap of a single nucleotide is then filled by DNA polymerase and DNA ligase. The net result is that the U that was created by accidental deamination is restored to a C.
  • c)Was ist nucleotide excision repair? Welche Arten von Mutationen werden dadurch repariert? Nucleotide excision repair ist ein Reparatursystem z.B. von einem Pyrimidin-Dimer. Insgesamt ist es aber sehr universell und kann viele DNA damages erkennen und beheben. After a multienzyme complex has recognized a bulky lesion such as a pyrimidine dimer, one cut is made on each side of the lesion, and an associated DNA helicase then removes the entire portion of the damaged strand. The multienzyme complex in bacteria leaves the gap of 12 nucleotides shown; the gap produced in human DNA is more than twice this size. The nucleotide excision repair machinery can recognize and repair many different types of DNA damage.
  • d)Fehler in Reparatursystemen können zu menschlichen Krankheiten führen. Geben Sie ein Beispiel. Dickdarmkrebs ( Fehler im Mismatch repair System), Hautkrebs (Fehler im nucleotide excision repair System)


1. DNA Sequenzierung kann über Basen-spezifischen Kettenabbruch in der Synthese (Sanger) und über Basen-spezifische Erkennung des Einbaus (454 Methode/Pyrosequencing) erfolgen. Bitte kurze Antworten, die die wesentlichen Vorgänge und Komponenten beschreiben. Zeichnungen mit Beschriftung möglich.

  • a) Wie funktioniert Sanger Sequenzierung? Welche Komponenten müssen in der Reaktionslösung vorhanden sein? Puffer und was alles noch?
    • Die Didesoxymethode nach Sanger wird auch Kettenabbruch-Synthese genannt und stellt eine enzymatische Methode dar. Ausgegangen wird von einem Primer bekannter Sequenz, der sich an den zu sequenzierenden DNA-Einzelstrang anlagert. Dieser Einzelstrang ist gleichzeitig die Matrize für die DNA-Synthese durch die DNA-Polymerase. In vier sonst gleichen Ansätzen (alle beinhalten die vier Nukleotide) wird je ein Nukleotid als ddNTP hinzugegeben (werden ddNTPs hinzugegeben, stoppt die Synthese, da keine 3’-OH-Gruppe für die Verknüpfung mit der nächsten Phosphatgruppe zur Verfügung steht). Somit entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die jedoch in jedem Ansatz stets mit demselben ddNTP enden. Nach der Sequenzier-Reaktion werden die fluoreszenzmarkierten Kettenabbruch-Produkte (entweder der Primer oder das ddNTP ist markiert) aus jedem Ansatz im Gel der Länge nach aufgetrennt. Durch Vergleich der vier Ansätze kann die Sequenz abgelesen werden (die abgelesene Sequenz entspricht dabei dem coding-strand, welcher natürlich komplementär zum template-strand ist).

In einer Sequenzierreaktion müssen vorhanden sein: Puffer, DNA-template, dNTPs, ddNTPs, DNA-Polymerase, Primer (die Primer-Sequenz muss in der zu sequenzierenden DNA einmal enthalten sein – das ist für den Beginn der DNA-Synthese notwendig und garantiert außerdem, dass alle neu synthetisierten DNA-Moleküle an der selben Stelle beginnen).

  • b) Wie funktioniert Pyrosequencing? (ohne die genaue enzymatische Reaktion, die ATP erzeugt)
    • Die Pyrosequenzierung nutzt wie die Sanger-Sequenzierung die Fähigkeit der DNA-Polymerase zum Ablesen der DNA. Allerdings wird die DNA-Polymerase gewissermaßen „in Aktion” beobachtet wie sie nacheinander einzelne Nukleotide an einen neusynthetisierten DNA-Strang anhängt. Der erfolgreiche Einbau eines Nukleotids wird durch ein ausgeklügeltes Enzymsystem unter Beteiligung von Luziferase in einen Lichtblitz übersetzt und von einem Detektor erfasst. Die zu sequenzierende DNA dient als Matrizenstrang und liegt einzelsträngig vor. Ausgehend von einem Primer erfolgt die Strangverlängerung Nukleotid um Nukleotid durch kontrollierte Zugabe von NTPs. Bei Zugabe des passenden Nukleotids erhält man ein Signal, bei den unpassenden NTPs bleibt der Lichtblitz aus. Da überschüssiges NTP schnell aus der Lösung entfernt wird, kommt es zu keiner Vermischung der Signale. Werden mehrere gleiche Nukleotide hintereinander eingebaut, erhält man ein zur Nukleotidzahl proportional stärkeres Signal.
  • c) Bei der automatischen Sanger Methode wird lineare PCR verwendet. In welchem Schritt? Weshalb? **Lineare PCR wird bei der Sanger Methode als Sequenzier-Reaktion eingesetzt (Denaturierung, Primerhybridisierung, Elongation). Im Unterschied zur normalen PCR ( exponentieller Produktanstieg) wird hier nur ein Primer zugegeben, sodass die DNA nur linear amplifiziert wird. Das hat zur Folge, dass einerseits geringere DNA-Mengen sequenziert werden können, andererseits aber größere Leseweiten (>1000 Nukleotide) erreicht werden können.
  • d) Wie funktioniert lineare PCR? Wieviel Moleküle erhält man, wenn man von 1000 Molekülen ausgeht und durch 30 Zyklen geht (theoretisch)?
    • Lineare PCR kommt zu Stande, wenn man nur einen Primer hinzugibt. Somit wird verhindert, dass die Produktmenge (Ziel-DNA) exponentiell ansteigt. Nach 30 Zyklen können theoretisch 1000*30 = 30000 Moleküle entstanden sein.

2. Telomere

  • a) Was sind Telomere, welche Sequenzen sind in Telomeren enthalten?
    • Telomere sind die natürlichen einzelsträngigen Chromosomenenden linearer Chromosomen. Sie sind für die Stabilität der Chromosomen ein wesentliches Strukturelement. Ihre Struktur ist nicht eindeutig aufgeklärt, doch man nimmt an, dass das 3’ überhängende Ende sich mit sich selber „paart“ und dabei abnormale GG-Bindungen bildet (Hoogsteen-Bindungen). Der entstandene Doppelstrang paart sich erneut mit sich selber und bildet somit eine Quadrupolhelix aus.

Telomere besitzen einen hohen GT-Gehalt, der hochrepetitiv ist. Bei Säugern ist die Nukleotid-Sequenz TTAGGG z.B. mehr als 3000mal wiederholt (bei Labormäusen sogar bis zu 4000mal).

  • b) Warum sind spezielle Telomersequenzen notwendig? Warum nicht einfach Kettenabbruch?
    • Das Enzym Telomerase besteht aus einem Protein und einem RNA-Anteil, der bei der Telomerverlängerung als Matrize dient. D.h. die darin enthaltene Sequenz (beispielsweise CUAACCCUAAC beim Menschen) ist komplementär zu den Telomersequenzen. Gäbe es also keine speziellen Telomersequenzen, so könnte die Telomerase weder die Telomere erkennen, noch diese binden und verlängern. Im Falle von Kettenabbruch in der Telomersequenz würde das als freies Ende erkannt werden und freie Enden dürfen in der Zelle nicht vorkommen, da sie durch diverse Enzyme (z.B. Exonukleasen oder Reparatursysteme) angegriffen würden und somit instabil sind.
  • cd) Was ist Telomerase, aus welchen Komponenten besteht sie und welche Reaktion katalysiert sie?
    • Telomerase ist ein Enzym, das aus einem Protein-und einem langen RNA-Anteil besteht. Es ist eine reverse Transkriptase, die den RNA-Anteil als Matrize benutzt. Es stellt die Endstücke der Chromosomen (die so genannten Telomere) wieder her. Bei jeder Zellteilung geht ein Stück (ca. 100 Nukleotide) der Telomere verloren. Die Telomerase verhindert durch die Wiederherstellung der Telomere, dass die Chromosomen mit jeder Zellteilung kürzer werden, was schließlich zum Zelltod führen würde.

3. Eukaryotische Transkription

  • a) wieso kann ein Transkriptionsfaktor an eine spezifische DNA Sequenz binden, wenn ein geschlossener Doppelstrang vorliegt d.h. die Wasserstoffbrücken der Basen bereits geformt sind?
    • In den major groove und den minor groove ragen die Atome und Atomgruppen, die an die aromatischen Ringe der Purin- (A + G) und Pyrimidinbasen (T + C) gebunden sind  z.B. -NH2, -O, -CH3). Ein Protein kann nun über seine Aminosäurereste (Seitengruppen) mit diesen Atomen in Wechselwirkung treten (z.B. Wasserstoffbrücken oder hydrophobe Wechselwirkungen bilden). Da AT und GC verschiedene Substituenten haben, können Proteine verschiedene Basenpaar-Sequenzen erkennen, ohne die DNA aufschmelzen zu müssen. Neben den wichtigsten Interaktionen (H-Brücken und hydrophobe WW) spielen aber auch vdW-Kräfte eine Rolle und bei bestimmten pH-Werten auch ionische WW).
  • b) Was für Sequenzen gibt es in einem eukaryotischen Promoter, wodurch unterscheidet er sich von einem prokaryotischen Promoter?
    • Prokaryotischer Promotor:
    • +1-Element  Transkriptionsstart
    • -10-Element  Pribnow-Box  Konsensussequenz TATAAT
    • -35-Element  Konsensussequenz TTGACA 
  <-- upstream                              downstream -->

5'-XXXXXXXPPPPPXXXXXXPPPPPPXXXXGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGXXXX-3' 

      -35       -10         Gene to be transcribed
    • (note that the optimal spacing between the -35 and -10 sequences is 17 bp)
  • Eukaryotischer Promotor:
    • +1-Element  TSS (transcription start site)
    • ~-30 TATA-Box
    • –URS (upstream repressing sequence)  Repressor
    • –UAS (upstream activating sequence)  Enhancer
    • Eukaryotische Promotoren sind sehr unterschiedlich und dadurch sehr schwer zu charakterisieren. Sie liegen typischerweise upstream des Transkriptions-Startpunkts und somit auch upstream des zu transkribierenden Gens. Sie können regulatorische Element mehrere kb vom Startpunkt entfernt haben. Manche (aber bei weitem nicht alle) eukaryotischen Promotoren haben eine TATA-Box (Konsensussequenz TATAAA), die TATA-box-binding-proteins bindet (TATA-box-binding-proteins helfen bei der Bildung des RNA-DNA-Transkriptionskomplexes). Typischerweise liegt die TATA-Box sehr nahe zum Transkriptionsstartpunkt (<50b). Die regulatorischen Elemente von eukaryotischen Promotoren binden generell Proteine, die man Transkriptionsfaktoren nennt. Sie sind ebenfalls in der Bildung des Transkriptionskomplexes involviert.
  • c) Was für Funktionen werden von den verschiedenen Komponenten der RNA Pol II und anderen Teilen des Transkriptionskomplexes erfüllt? ( Keine Aufzählung der einzelnen Komponenten mit Namen)
    • –RNA-Polymerase II ( für protein-kodierende Gene zuständig) schreibt die doppelsträngige DNA in einzelsträngige RNA um ( also Anhängen eines NTP an die wachsende RNA-Kette aufgrund der Basenabfolge am DNA-Matrizenstrang)
    • –RNA-Polymerase II trägt pre-mRNA-processing proteins (splicing factors, capping factors, polyadenylation factors)
    • –Transkriptionsfaktoren erkennen die Promoterregion, vermitteln die Bindung der RNA-Polymerase II daran und werden für die Initiation benötigt.
    • –ein weiterer Transkriptionsfaktor phosphoryliert die RNA-Polymerase, woraufhin die anderen TFs abfallen und die Elongationsphase begonnen werden kann.
    • –Aktivatorproteine binden Enhancer und sind für die Initiation erforderlich
    • –weitere Aktivatoren stimulieren chromatin-remodeling-complex (CRC) und Histon-Acetylasen
    • –Mediator vermittelt den Kontakt zwischen Enhancer und RNA-Polymerase II  somit können weit entfernt gelegene Aktivatoren die Transkription immer noch beeinflussen
  • d) Was für eine Rolle spielen Nukleosomen bzw. ihre Komponenten in der Transkriptionskontrolle?
    • Nukleosomen sind fundamentale Untereinheiten von eukaryotischem Chromatin. Sie verpacken die DNA im Zellkern in Chromosomen und regulieren die Genexpression. Dabei bestehen Nukleosomen selber aus Histonen (Proteine). Abgesehen von der „Kompaktmachung“ der dsDNA im Zellkern, haben sie noch eine wichtige Rolle in der Transkriptionskontrolle: sie hindern RNA-Polymerasen daran, unnötigerweise an Promotorregionen bestimmter Gene zu binden. D.h. wenn die Zelle das aus diesem bestimmten Gen entstehende Protein nicht braucht, wird es auch nicht transkribiert.

4. In menschlichen Genom und im Mausgenom gibt es eine Familie von repetitiven Sequenzen, die miteinander verwandt sind, mit dem Namen Alu (im Menschen) bzw. B1 in der Maus.

  • a) Kodieren menschliche Alu Sequenzen für ein Protein?
    • Alu Sequenzen sind eine Familie repetitiver DNA-Sequenzen im Genom von Menschen (und auch Primaten). Sie gehören zu den SINE (short interspersed nucleotide elements) und sind ca. 300bp lang. Über 10% des menschlichen Genoms bestehen aus Alu-Integrationen; das entspricht einer Kopienzahl von über 1 Million. Die Sequenz wurde nach dem Restriktionsenzym Alu (aus Arthrobacter luteus) benannt, weil es diesen Abschnitt in zwei Teile trennt. Dabei entsteht ein 170bp- und ein 130bp-Element. Alu Sequenzen sind nicht-kodierend (wie alle repetitive Sequenzen).
  • b) Wieviele Kopien davon gibt es ungefähr im menschlichen Genom: 10, 1000, 1000 000?
    • 1 Million (speziell am Centromer ist die Konzentration an repetitiven Sequenzen erhöht)
  • c) Haben sie alle die gleiche Sequenz? Warum?
    • Nein. Alu-Sequenzen haben zwar ähnliche Sequenzen, doch nicht identische. Entstanden sind sie durch die reverse Transkription von kleinen RNA-Molekülen (7 SL-RNA).
    • Frischauf: Die einzelnen Alu Sequenzen im menschlichen Genom sind nicht identisch, sondern teilen sich auf verschiedene Familien auf, die meisten sind einander aber sehr ähnlich und hybridisieren gut miteinander.
  • d) Sind die Kopien an vergleichbaren Stellen in Mensch und Maus (wenn man ein kleines Stück Genom betrachtet, zum Beispiel die Umgebung von einigen nebeneinander liegenden Genen. die in Mensch und Maus in derselben Anordnung vorkommen). Warum?
    • Die verschiedenen Kopien von Alu sind ziemlich gleichmäßig im Genom verstreut, ein humanes DNA-Fragment von 20kb hat eine gute Chance, eine solche repetitive Sequenz zu enthalten
Von „http://www.bio-salzburg.at/wiki/VO_Einf%C3%BChrung_in_die_molekulare_Genetik%2C_Prof._Frischauf%2C_Fragenkatalog“
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